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1 兒童肝移植免疫耐受的特點(diǎn) 免疫耐受是指器官移植受者在停止免疫抑制藥物治療的情況下，移植物保持正常的功能，且不影響受者的免疫功能，保持對(duì)感染、腫瘤等正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)［4］。20世紀(jì)90年代初，美國的Starzl教授團(tuán)隊(duì)［5］最早發(fā)現(xiàn)了肝移植免疫耐受現(xiàn)象。在11例因依從性差或免疫抑制劑不良反應(yīng)而停用免疫抑制劑治療的肝移植患者中，發(fā)現(xiàn)在6個(gè)月至13年的隨訪過程中，這些受者移植肝功能保持著正常。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)開始有目的的通過逐步停用免疫抑制劑，對(duì)包括95例肝移植患者誘導(dǎo)術(shù)后免疫耐受進(jìn)行觀察，研究結(jié)果令人振奮，18例患者可完全停止服用免疫抑制劑，隨訪時(shí)間達(dá)34個(gè)月［6］。隨后，該現(xiàn)象在一組包括20例兒童親屬活體肝移植受者的研究中也得到驗(yàn)證［7］。 這種現(xiàn)象與肝臟作為一個(gè)免疫調(diào)節(jié)器官的獨(dú)特解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)，因此也稱其為免疫特惠器官。肝臟是雙血供器官，強(qiáng)大的血流可以稀釋免疫復(fù)合物并減少免疫復(fù)合物的形成和沉積［8］；肝臟內(nèi)大量的肝竇上皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）也與肝臟內(nèi)部的免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)［8-11］；肝臟強(qiáng)大的再生功能可以克服輕度的排斥反應(yīng)［12］。 與成人肝移植患者相比，免疫耐受現(xiàn)象在兒童肝移植患者中的比例更高［7］。此前報(bào)道，成人肝移植患者出現(xiàn)免疫耐受的比例為20%左右，而兒童肝移植患者術(shù)后出現(xiàn)操控性耐受的比例可達(dá)60%［13］。在Takatsuki等［14］的研究中，63例因藥物導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥而停止服用免疫抑制劑的活體肝移植兒童受者中，24例出現(xiàn)免疫耐受，這些兒童平均停藥時(shí)間接近2年，接受肝移植時(shí)的平均年齡為1.1歲，提示年齡較低在誘導(dǎo)免疫耐受上可能更有優(yōu)勢。在兒童時(shí)期，胸腺是一個(gè)高度強(qiáng)大的免疫器官，是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的場所，對(duì)于誘導(dǎo)供體特異性耐受非常關(guān)鍵。胸腺調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg細(xì)胞）由兩部分組成，一部分是由CD4單陽性胸腺細(xì)胞新生成的Treg細(xì)胞，另一部分是進(jìn)入胸腺再循環(huán)的外周Treg細(xì)胞。在人類和小鼠中，初始型Treg細(xì)胞幾乎全部依賴于胸腺產(chǎn)生。兒童胸腺中的Treg細(xì)胞非常豐富，1 g胸腺組織所含Treg細(xì)胞大約是1 ml外周血的500倍，而且在擴(kuò)增后功能穩(wěn)定［15］。新生兒胸腺的微解剖屏障對(duì)外來細(xì)胞的限制沒有成人胸腺那么嚴(yán)格，更容易產(chǎn)生供體抗原特異性Treg細(xì)胞；通過消耗進(jìn)入胸腺的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，提高誘導(dǎo)中樞免疫耐受的效果。 2 誘導(dǎo)免疫耐受的主要方法 免疫耐受的誘導(dǎo)與維持不是某一種調(diào)節(jié)機(jī)制的作用，而是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，包括凋亡、調(diào)節(jié)性細(xì)胞的獲取、抑制增殖等。現(xiàn)階段誘導(dǎo)免疫耐受的方法主要有克隆無能、克隆清除與免疫調(diào)節(jié)等。 克隆無能是指T淋巴細(xì)胞僅與抗原遞呈細(xì)胞上的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物結(jié)合，激活第一信號(hào)，而沒有完成由抗原遞呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表面黏附分子結(jié)合提供的第二信號(hào)，即共刺激信號(hào)，使T淋巴細(xì)胞不能繼續(xù)分化，不具有完整的免疫功能，且可進(jìn)一步被誘導(dǎo)凋亡。目前研究較多的是B7/CD28共刺激通路、CD40/CD40L共刺激通路、CD80/CD86共刺激通路以及OX40/OX40L共刺激通路。其中，OX40/OX40L共刺激途徑可以促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖、存活、遷移，可促進(jìn)Treg細(xì)胞擴(kuò)增，但擴(kuò)增的Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的抑制作用較弱，且細(xì)胞內(nèi)程序性死亡受體1上調(diào)［16］。外源性IL-2可阻止這一過程，增強(qiáng)Treg細(xì)胞活性［17-18］。 克隆清除是指胸腺通過陰性選擇去除（中央型清除）其內(nèi)未成熟的特異性T淋巴細(xì)胞克隆，或直接清除外周循環(huán)中已成熟的特異性T淋巴細(xì)胞克?。ㄖ車颓宄瑥亩T導(dǎo)并維持免疫耐受。胸腺作為T淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的中樞免疫器官，發(fā)揮著重要作用。除此以外，造血干細(xì)胞移植也可誘導(dǎo)免疫耐受，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)已證實(shí)輸注全骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、CD34細(xì)胞、脾細(xì)胞均可誘導(dǎo)免疫耐受［19］。造血干細(xì)胞移植誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制主要是誘導(dǎo)受者產(chǎn)生嵌合體，以抑制移植術(shù)后的排斥反應(yīng)［20-22］。使用單克隆或多克隆抗體清除外周效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，減弱受者的反應(yīng)，可獲得外周性免疫耐受。目前研究較多的單抗有抗IL-2受體單抗、抗CD4單抗、抗CD25單抗等，而多克隆抗體在臨床應(yīng)用較多的為抗胸腺細(xì)胞球蛋白。 免疫調(diào)節(jié)是指利用具有免疫抑制功能的細(xì)胞亞群或細(xì)胞因子，發(fā)揮其負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受。其研究的熱點(diǎn)包括Treg細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞以及TGFβ、IL-10等［23-24］。其中，尤以Treg細(xì)胞最為引人關(guān)注。 Treg細(xì)胞主要在胸腺與外周淋巴器官中發(fā)育，F(xiàn)oxp3是CD4+Treg細(xì)胞分化、發(fā)育、保持功能穩(wěn)定的重要因子，也是其最重要的標(biāo)志物。筆者發(fā)現(xiàn)兒童肝移植患者在發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)，外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低，在抗排斥治療后進(jìn)一步下降，1周后仍不能恢復(fù)正常［25］。而在停用免疫抑制劑5年以上的肝移植患者中，肝穿刺組織中的Treg細(xì)胞比例則明顯增加［26］。Hajkova等［27］發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)中加用雷帕霉素可以顯著地提升體外培養(yǎng)體系中Foxp3的表達(dá)。而增加TGFβ、IL-2等細(xì)胞因子可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化、修復(fù)調(diào)節(jié)功能［28］，使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還可以誘導(dǎo)幼稚T淋巴細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化［29］。動(dòng)物移植模型已經(jīng)證實(shí)供體抗原特異性Treg細(xì)胞在防止排斥反應(yīng)方面優(yōu)于體外培養(yǎng)的多克隆Treg細(xì)胞［30］。利用輸注體外培養(yǎng)的供體抗原特異性Treg細(xì)胞，7例活體肝移植患者產(chǎn)生了免疫耐受［31］。但體外培養(yǎng)的Treg細(xì)胞壽命較短，在一項(xiàng)臍帶血Treg細(xì)胞預(yù)防移植物抗宿主病的研究中，輸注的Treg細(xì)胞的半衰期大約在20 d左右，且與輸注的Treg細(xì)胞劑量無關(guān)［32］，而且受他克莫司的抑制作用比較明顯［33］。而利用基因工程技術(shù)，通過T淋巴細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）產(chǎn)生的供體抗原特異性Treg細(xì)胞（TCR-Treg）可以較好的維持抗原特異性［34］。在此基礎(chǔ)上，將供體主要組織相容性復(fù)合物與Treg細(xì)胞結(jié)合，得到嵌合抗原受體Treg細(xì)胞，彌補(bǔ)了TCR-Treg細(xì)胞的缺陷［35］。但嵌合抗原受體Treg細(xì)胞的不足是輸注后可能引起細(xì)胞因子“風(fēng)暴”和神經(jīng)系統(tǒng)毒性，另外標(biāo)靶抗原的選擇、特異性抗體的產(chǎn)生難度較大，容易出現(xiàn)細(xì)胞衰竭［36］。 3 臨床操控性免疫耐受 多項(xiàng)研究［4，37］發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過篩選的患者中，成功撤除免疫抑制劑且維持移植物功能正常的比例為15%~60%，隨訪達(dá)12~140個(gè)月。對(duì)于臨床操控性免疫耐受，并無具體的描述與定義。誘導(dǎo)操控性免疫耐受的肝移植受者的初步要求包括移植術(shù)后持續(xù)較長一段時(shí)間內(nèi)保持移植肝功能良好、撤藥前患者未出現(xiàn)經(jīng)證實(shí)的排斥反應(yīng)、受者術(shù)前原發(fā)病非免疫相關(guān)性疾病。Banff工作組對(duì)操控性免疫耐受給出的一個(gè)較為保守的解釋是：在撤藥或完全停藥的1、3、5、10年中沒有不良的臨床表現(xiàn)、沒有肝損傷的生化學(xué)或組織病理學(xué)證據(jù)［38］。 對(duì)于臨床操控性免疫耐受執(zhí)行過程中的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)及監(jiān)測指標(biāo)則差異較大。對(duì)于具體的時(shí)間要求，有的研究［4］認(rèn)為停藥4個(gè)月以上，未發(fā)生排斥反應(yīng)，肝活組織檢查提示未發(fā)生排斥反應(yīng)即達(dá)到免疫耐受，也有研究［39］認(rèn)為必須達(dá)到停藥12個(gè)月以上。無論是藥物減量過程中，還是撤藥后，組織學(xué)評(píng)估都非常關(guān)鍵［40］。Feng等［41］的團(tuán)隊(duì)則認(rèn)為撤藥方案中的關(guān)鍵就是隨訪中的組織學(xué)檢查，潛在耐受患者需在停用免疫抑制劑的0、1、3、5、8年接受5次肝活組織檢查，避免持續(xù)性或進(jìn)展性的炎癥反應(yīng)或纖維化?？勺鳛橥Ｋ幍念A(yù)測因素包括低齡、移植與開始停藥的時(shí)間間隔較長、單用他克莫司、淋巴細(xì)胞反應(yīng)性低、肝活組織檢查門靜脈區(qū)炎癥反應(yīng)少、移植術(shù)后人類白細(xì)胞抗原相關(guān)抗體低表達(dá)［4，6，13，42］。有研究［43］認(rèn)為早期無排斥反應(yīng)、人類白細(xì)胞抗原-A匹配、后期Treg細(xì)胞比例升高是操控性耐受的相關(guān)因素。表1簡要總結(jié)了近年來兒童肝移植臨床操控性免疫耐受的開展情況。 相比于上述臨床因素，免疫學(xué)指標(biāo)更為引人關(guān)注，主要集中于具有免疫抑制作用的細(xì)胞亞群。Kim等［47］認(rèn)為Treg細(xì)胞可以作為免疫耐受的一個(gè)評(píng)估指標(biāo)。在肝移植患者減少免疫抑制劑過程中，Treg/Th17比例也可以預(yù)測是否能出現(xiàn)肝移植術(shù)后免疫耐受［48］。Lau等［49］研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)操控性耐受的兒童肝移植患者中CD4+CD5+CD25+CD38-/loCD45RA細(xì)胞比例明顯高于服用低劑量免疫抑制劑的穩(wěn)定患者。Kong等［50］發(fā)現(xiàn)肝移植免疫耐受患者體內(nèi)γδT淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞型高于健康人群，同時(shí)它也是移植免疫耐受患者體內(nèi)主要的亞型。兒童肝移植受者中，外周血與移植物中γδT淋巴細(xì)胞顯著增高［51］。然而Puig-Pey等［52］發(fā)現(xiàn)病毒感染的免疫抑制患者中也可出現(xiàn)γδT淋巴細(xì)胞增多的現(xiàn)象，因此不能將γδT淋巴細(xì)胞的增多作為評(píng)判移植免疫耐受的依據(jù)。Goldschmidt等［53］通過CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞、CD56/16+NK細(xì)胞、CD56+T淋巴細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、粒細(xì)胞以及50種不同的細(xì)胞因子、趨化因子、血管生成因子，還包括移植肝中的miRNA表達(dá)等綜合評(píng)估患者免疫狀態(tài)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究者在基因水平開始尋找耐受相關(guān)性。Li等［54］對(duì)NK細(xì)胞轉(zhuǎn)錄信號(hào)進(jìn)行基因檢測后發(fā)現(xiàn)，其在耐受患者中的敏感度達(dá)100%，特異度達(dá)83%。鐘克波等［55］利用基因芯片和RT-PCR技術(shù)，對(duì)血液樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄圖譜分析，檢出13種在免疫細(xì)胞中高表達(dá)的特異性免疫耐受基因。 4 目前存在的問題 總體而言，實(shí)現(xiàn)臨床免疫耐受、完全撤除免疫抑制劑方案的基本內(nèi)容應(yīng)包括篩選合適受者、逐步撤藥、密切監(jiān)測。其需要解決的問題主要是如何制訂入組的篩選標(biāo)準(zhǔn)？依靠哪些檢測指標(biāo)評(píng)判撤藥過程及最終免疫耐受狀態(tài)？病例數(shù)量與特性是否充分、具有代表性？利用科技的進(jìn)步，從臨床現(xiàn)象能否探索出誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制？目前，對(duì)于上述問題尚缺乏可靠答案。 現(xiàn)階段，誘導(dǎo)肝移植免疫耐受相關(guān)研究在嚙齒類等小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的成果較為滿意，但在靈長類大動(dòng)物與臨床應(yīng)用中仍面臨較大困難。尤其是臨床工作中，缺乏實(shí)現(xiàn)操控性免疫耐受的具體方案與標(biāo)準(zhǔn)。此外，尚存在倫理學(xué)爭議，主要體現(xiàn)在撤藥后患者所面臨的風(fēng)險(xiǎn)。 在常規(guī)監(jiān)測中，肝功能檢查最為常見，但在肝功能正常的情況下，亞臨床炎癥或進(jìn)展性纖維化亦常出現(xiàn)，缺乏移植物的組織學(xué)證據(jù)，不足以證實(shí)已安全停用免疫抑制劑及操控性耐受的成功［56］。撤藥過程中及停藥后移植肝情況評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)為肝活組織檢查，但是由于其為有創(chuàng)操作，存在出血等風(fēng)險(xiǎn)，并不適合于日常監(jiān)測，且活組織檢查對(duì)移植受者整體免疫狀況的評(píng)估價(jià)值有限［57］。 在成功停用免疫抑制劑后仍存在移植物丟失或纖維化的潛在風(fēng)險(xiǎn)［58］。在長期生存的規(guī)律使用免疫抑制劑而出現(xiàn)移植物炎癥或纖維化的兒童肝移植受者中，免疫抑制不足常被認(rèn)為是可能的病因［59-61］。在Yoshitomi等［44］的研究中，15%（87/581例）的兒童活體肝移植受者成功撤除免疫抑制劑、出現(xiàn)了免疫耐受，但在隨訪近10年后，與接受正常免疫抑制劑治療的兒童相比，免疫耐受兒童受者的肝纖維化發(fā)生率較高，在重新給予免疫抑制劑治療后，肝纖維化有所減輕。但在Feng等［41］報(bào)道的一項(xiàng)多中心研究中，在完全撤除免疫抑制劑隨訪5年后，兒童肝移植受者的肝纖維化程度降低，研究者認(rèn)為肝臟自身獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制會(huì)逆轉(zhuǎn)肝纖維化。 另一方面，對(duì)于撤藥可消除免疫抑制劑的毒副作用而言，Pons等［62］發(fā)現(xiàn)撤除免疫抑制劑后，可改善肝移植術(shù)后患者的腎功能，同時(shí)還可降低高血壓、高脂血癥及高尿酸血癥等代謝性疾病的發(fā)生率。但Perito等［63］的研究則與之相左，他們的成果證實(shí)撤除鈣調(diào)神經(jīng)蛋白抑制劑類免疫抑制劑并不會(huì)影響代謝綜合征的發(fā)生。而Zheng等［64］在恒河猴的動(dòng)物免疫耐受實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，皮膚移植物在嵌合體產(chǎn)生后可穩(wěn)定生存24個(gè)月，但存在巨細(xì)胞病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。 5 小結(jié) 肝移植操控性免疫耐受并不是受體完全缺失免疫反應(yīng)，關(guān)鍵在于移植肝抵抗或者說防御可導(dǎo)致移植物損傷的免疫反應(yīng)的能力；兒童受者在免疫抑制劑撤除過程中很少出現(xiàn)移植物丟失，這也表明成功撤除免疫抑制劑不會(huì)影響移植肝功能［65］。但免疫耐受的實(shí)現(xiàn)是一個(gè)持續(xù)的過程，最大的挑戰(zhàn)在于安全撤除免疫抑制劑后確定產(chǎn)生耐受的標(biāo)志物，因此折中的方案可能是應(yīng)用最低劑量的免疫抑制劑而保持移植物功能正常［47］。 隨著手術(shù)技術(shù)的成熟，器官移植的關(guān)注點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)移到提高移植受者的生存質(zhì)量與遠(yuǎn)期存活。實(shí)現(xiàn)免疫耐受是器官移植在挽救患者生命的同時(shí)所達(dá)到的最理想狀態(tài)。盡管目前的研究與文獻(xiàn)尚不足以協(xié)助臨床醫(yī)生準(zhǔn)確使用免疫抑制劑及判斷是否出現(xiàn)免疫耐受，隨著科技的發(fā)展，更多、更有效的無創(chuàng)性檢測手段的出現(xiàn)將為臨床操控性免疫耐受提供助力，為今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為兒童肝移植提供誘導(dǎo)免疫耐受的新策略。 |
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