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對(duì)于分子生物學(xué)來(lái)講，生物分析手段的發(fā)展，是闡明機(jī)理的必要條件。 在研究分子間相互作用的道路上，人們不斷探索，總結(jié)出很多方法，免疫技術(shù)，晶體衍射，核磁共振等。1948年，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）理論被首次提出，它可以測(cè)定1.0-6.0nm距離內(nèi)分子間的相互作用。1967年，這一理論得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將1.0-6.0nm的距離稱(chēng)為光學(xué)尺。二十世紀(jì)八十年代出，通過(guò)科學(xué)家的不斷探索，F(xiàn)ret技術(shù)成功運(yùn)用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中。自Fret熒光共振能量技術(shù)誕生以來(lái)，已結(jié)合多種先進(jìn)的技術(shù)和方法，如電子顯微鏡，X射線衍射等，推動(dòng)了分子生物學(xué)檢測(cè)手段的發(fā)展。 作用原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，是采用物理方法去檢測(cè)分子間的相互作用的方法。他適用于在細(xì)胞正常的生理?xiàng)l件下，驗(yàn)證已知分子間是否存在相互作用。此方法的檢測(cè)原理如下； 將我們要檢測(cè)的蛋白（如圖X和Y），分別偶聯(lián)上D和A熒光蛋白，D和A是一對(duì)熒光物質(zhì)，我們稱(chēng)之為供體（donor）和受體（acceptor）。當(dāng)用430nm的紫光去激發(fā)X融合蛋白時(shí)，它能夠產(chǎn)生490nm的藍(lán)色熒光；同樣，當(dāng)我們用490nm的藍(lán)光去激發(fā)Y融合蛋白時(shí)，它能夠產(chǎn)生530nm的黃色熒光。（結(jié)合圖1） 。 當(dāng)?shù)鞍譞和Y間沒(méi)有相互作用時(shí)（兩者的空間距離>10nm），融合蛋白X和Y分別產(chǎn)生相應(yīng)的熒光而被檢測(cè)到， 如果蛋白X和Y間存在相互作用（兩者的空間距離需<10nm，結(jié)合圖2），用紫光激發(fā)融合蛋白X其產(chǎn)生的藍(lán)光會(huì)被融合蛋白Y吸收，從而產(chǎn)生黃色熒光，這時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)將檢測(cè)不到藍(lán)色熒光的存在。這時(shí)因?yàn)槟芰繌腦融合蛋白轉(zhuǎn)移到了Y融合蛋白，這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。 技術(shù)難點(diǎn)一個(gè)理想的Fret相互作用體系，要求要有一對(duì)合適的熒光物質(zhì)， 即供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有明顯的重疊。且當(dāng)供體的激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)對(duì)受體無(wú)影響，供體和受體的發(fā)射光譜要完全分開(kāi)，否則容易造成光譜干涉，而使反應(yīng)體系不穩(wěn)定。目前，較為常用的供體-受體分子對(duì)，主要有綠色熒光蛋白類(lèi)（GFPs）和染料類(lèi)。綠色熒光蛋白類(lèi)有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP等，染料類(lèi)的有Cy3-Cy5，F(xiàn)ITC-Rhodamine等。且這些熒光物質(zhì)要能夠標(biāo)記在研究對(duì)象上。 應(yīng)用要求供體熒光基團(tuán)和受體熒光基團(tuán)的空間距離要<10nm； 供體的發(fā)射光譜與受體的接收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B； 供體、受體分子在量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、水溶性、抗干擾能力等方面要求較高。
優(yōu)缺點(diǎn)| 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 在活細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件下進(jìn)行檢測(cè)，觀察大分子在細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)象變化與相互作用，并彌補(bǔ)了需破碎細(xì)胞檢測(cè)相互作用的缺點(diǎn)；
靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞水平的研究，研究單個(gè)受體分子；
可與多種儀器和技術(shù)結(jié)合使用，如顯微鏡，色譜技術(shù)，電泳，流失細(xì)胞技術(shù)等； | 應(yīng)用比較局限，一般需要在待檢測(cè)分子上偶聯(lián)熒光物質(zhì)（加上標(biāo)記）；
對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較高，如供受體的光譜重疊不好，會(huì)導(dǎo)致熒光干擾，對(duì)供受體的抗干擾能力，水溶性等要求高；
需要不斷探索合適的供體和受體，且能夠標(biāo)記分子；
難以觀察瞬時(shí)的分子間作用，檢測(cè)要求大量的樣品； |
應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用 膜蛋白的研究 細(xì)胞膜受體蛋白間的相互作用 細(xì)胞凋亡的研究 核酸檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)述以熒光物質(zhì)CFP（供體）-YFP（受體）為例，檢測(cè)AB蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。 細(xì)胞培養(yǎng)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)特定的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，觀察檢測(cè)分子在細(xì)胞內(nèi)的相互作用； 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建質(zhì)粒載體CFP-A和YFP-B，將檢測(cè)的AB蛋白分別偶聯(lián)上熒光蛋白CFP和YFP，并將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)； 檢測(cè) FRET：質(zhì)粒載體CFP-A和YFP-B轉(zhuǎn)染細(xì)胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢測(cè)，是否發(fā)生Fret； FRET圖像采集： 確定 FRET 配對(duì)的激發(fā)波長(zhǎng)， 藍(lán)光被調(diào)諧分別用于探測(cè)最大和最小的供體和受體信號(hào)， 最大供體信號(hào)和最小受體信號(hào)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)用于收集雙表達(dá)細(xì)胞的 FRET信號(hào)。調(diào)整激光變化，以便獲取最大 CFP 信號(hào)和最小 YFP 信號(hào)的激發(fā)光波長(zhǎng)， 采集供體和受體圖像，收集 FRET 信號(hào)。每個(gè)細(xì)胞 FRET 檢測(cè)重復(fù) 3 次，每種轉(zhuǎn)染至少完成 6 個(gè)細(xì)胞的 FRET 檢測(cè); FRET 數(shù)據(jù)處理： 去除 FRET 信號(hào)中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號(hào)； 受體通路的FRET 信號(hào)需要對(duì)供體受體光譜靈敏度的變化進(jìn)行矯正、對(duì)自發(fā)熒光和光學(xué)噪聲進(jìn)行矯正； 利用矯正系數(shù)對(duì)雙標(biāo)定細(xì)胞進(jìn)行象素匹配矯正。
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