近日，北京林業(yè)大學(xué)林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心/生物學(xué)院林金星研究團(tuán)隊(duì)在綜合學(xué)術(shù)期刊SCIENCE CHINA Life Sciences 發(fā)表了題為The detection techniques for protein-protein interaction in vivo: principle, limitations and recent progress 的綜述文章。該綜述系統(tǒng)的總結(jié)了多種用于活體生物體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的生物技術(shù)，為研究者今后選擇最佳活體蛋白互作檢測(cè)方法提供參考。

分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，不僅可以從分子水平上闡釋蛋白質(zhì)功能，而且有助于揭示細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的分子機(jī)理。傳統(tǒng)檢測(cè)蛋白互作的技術(shù)（包括：pull-down, 酵母雙雜交和Co-IP等）大多是在非活體狀態(tài)中進(jìn)行，具有一定的局限性，因而無(wú)法提供活細(xì)胞內(nèi)特定的時(shí)空信息。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)發(fā)出了多種可用于活體生物體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的新技術(shù)，包括：FRET，BRET，BiFC和基于co-localization and co-tracking等，這些技術(shù)克服了非活體狀態(tài)分析蛋白互作的局限性，為研究蛋白互作提供了新的方法。

圖1：基于PCAs技術(shù)檢測(cè)蛋白互作示意圖

該論文重點(diǎn)介紹了活體檢測(cè)蛋白互作的三類技術(shù)，包括基于共振能量轉(zhuǎn)移的分析技術(shù)、蛋白片段互補(bǔ)技術(shù)和基于co-localization and co-tracking的分析技術(shù)，并對(duì)每種技術(shù)的原理、局限性以及發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)。

能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（Resonance Energy Transfer，RET）是指兩種不同分子在合適距離發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，這個(gè)距離大約在1-10nm之間。傳統(tǒng)的RET技術(shù)包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）。這兩種技術(shù)可以在無(wú)損細(xì)胞的狀態(tài)下，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的相互作用。但傳統(tǒng)的RET技術(shù)存在一定的局限性，例如不能用于檢測(cè)蛋白的熒光壽命以及多于兩個(gè)的蛋白之間的相互作用等。因此，該綜述除了介紹傳統(tǒng)RET技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)以外，重點(diǎn)介紹了基于傳統(tǒng)RET技術(shù)新開(kāi)發(fā)的檢測(cè)蛋白互作的技術(shù)，譬如single-molecule FRET (smFRET), FRET-fluorescence lifetime imaging microscopy (FRET-FLIM), SRET (BRET-FRET)等，并對(duì)這些新技術(shù)的原理、優(yōu)點(diǎn)、局限性及其應(yīng)用進(jìn)行了比較。

該綜述第二部分重點(diǎn)闡述了以蛋白片段互補(bǔ)分析技術(shù)（protein fragment complementation assay，PCA）為基礎(chǔ)研究蛋白相互作用的技術(shù)，主要包括雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)，例如把YFP熒光蛋白分成nYFP和cYFP兩部分，然后將兩個(gè)檢測(cè)蛋白A和B分別與nYFP和cYFP構(gòu)成融合蛋白A-nYFP和B-cYFP，最后通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)YFP熒光表達(dá)情況，從而檢測(cè)A和B蛋白的互作；基于熒光素酶的互補(bǔ)技術(shù)（The split luciferase system），把熒光素酶分成兩部分nLuc和cLuc，然后將兩個(gè)檢測(cè)蛋白A和B分別與nLuc和cLuc構(gòu)成融合蛋白A-nLuc和B-cnLuc，最后通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)luciferase酶活情況，從而來(lái)判斷A和B蛋白的互作。該部分不僅介紹了目前傳統(tǒng)PCA研究進(jìn)展，還歸納總結(jié)了不同PCA方法之間的差異以及優(yōu)缺點(diǎn)，并闡述了使用不同PCA時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)。本綜述除了介紹傳統(tǒng)的PCA原理和缺陷外，還進(jìn)一步綜述了PCA和其它蛋白檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用的方法，如：BiFC-based FRET和the biotin identification (BioID)，并針對(duì)性的對(duì)其存在的優(yōu)缺點(diǎn)以及使用范例進(jìn)行了概述。此外，本部分還介紹了一種研究蛋白互作的最新技術(shù)：cytoskeleton-based assay for protein-protein interaction (CAPPI)，并概括了其原理和使用方法。

綜述的最后一部分?jǐn)⑹龅氖?/span>基于co-localization and co-tracking檢測(cè)蛋白互作的技術(shù)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究使用共定位分析技術(shù)來(lái)確定兩個(gè)或多個(gè)蛋白可能發(fā)生的體內(nèi)相互作用。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)或多個(gè)不同熒光標(biāo)記蛋白成像后圖像共定位以及相關(guān)系數(shù)的計(jì)算，最終以相關(guān)性分析來(lái)確定其互作程度。過(guò)去，由于蛋白標(biāo)記與成像技術(shù)的限制（例如：衍射極限、時(shí)空分辨率以及活體成像等），共定位只能粗略的間接反應(yīng)蛋白互作情況，具有一定的局限性。隨著熒光標(biāo)記蛋白及其成像技術(shù)的發(fā)展，共定位技術(shù)判斷體內(nèi)蛋白互作精確程度有了大幅度的提升。在這里，作者重點(diǎn)介紹了近幾年開(kāi)發(fā)出的且更加適合連續(xù)、動(dòng)態(tài)及高時(shí)空分辨的新型分析技術(shù)和檢測(cè)方法，例如co-tracking of dual particles, single-molecule protein proximity index (smPPI), super-resolution co-localization, 3D colocalization, 3D dual-particle tracking等。這些技術(shù)的產(chǎn)生，不僅使蛋白互作檢測(cè)可視化，且在高時(shí)空分辨率狀態(tài)下真實(shí)還原了體內(nèi)蛋白相互作用的本質(zhì)，為今后研究生物體內(nèi)蛋白互作提供了新思路。

圖2：基于共定位技術(shù)檢測(cè)蛋白互作示意圖

林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心林金星教授為該論文的通訊作者，崔亞寧博士和張曦博士為該論文的第一作者。該論文得到了北京林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心、國(guó)家自然科學(xué)基金和高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃（111引智計(jì)劃）等項(xiàng)目的資助。

論文原文鏈接：

https://link./article/10.1007/s11427-018-9500-7