還是CCR5！中國學者NEJM發(fā)文，通過CRISPR基因編輯干細胞治療艾滋病和白血病患者

長生果與無花果 2019-09-14

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自二十世紀八十年代以來，艾滋病造成了重大的公共衛(wèi)生問題和社會問題。目前全世界有超過3700萬人感染HIV病毒，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計我國有150萬HIV感染者。

1996年，艾滋病領域研究取得了里程碑式進展，HIV入侵T細胞的主要共受體CCR5蛋白被發(fā)現(xiàn)（鄧宏魁教授是主要發(fā)現(xiàn)者之一）。

隨后的研究發(fā)現(xiàn)，CCR5基因呈缺陷型（CCR5-Δ32）的人群不會被R5嗜性HIV病毒感染。2007年，一名同時患有白血病和艾滋病的“柏林病人”在接受具有CCR5-Δ32突變的造血干細胞移植后，血清中的HIV病毒得到有效清除，實現(xiàn)了艾滋病的“功能性治愈”，成為世界首個被治愈的艾滋病患者。

因此，通過基因編輯敲除成體造血干細胞上CCR5基因，再將編輯后的細胞移植到艾滋病患者體內(nèi)有可能成為“功能性治愈”艾滋病的新策略。

2019年9月11日，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心陳虎研究組、北京大學鄧宏魁研究組、首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院吳昊研究組合作在《新英格蘭醫(yī)學雜志》（The New England Journal of Medicine）發(fā)表了題為：CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia 的研究論文。

該臨床試驗，利用CRISPR基因編輯技術，在人成體造血干細胞上進行CCR5基因編輯，實現(xiàn)了經(jīng)基因編輯后的成體造血干細胞在人體內(nèi)長期穩(wěn)定的造血系統(tǒng)重建。然后對一個患艾滋病和急性淋巴細胞白血病的27歲男性進行治療。治療后病人的急性淋巴白血病達到形態(tài)上的完全緩解，病人的T細胞呈現(xiàn)一定程度上對HIV病毒的抵抗能力，且未發(fā)現(xiàn)脫靶效應和副作用。

這項基因編輯是在成體造血干細胞上進行的，因此并不會對其他組織器官及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。該工作初步證明了基因編輯的成體造血干細胞移植的可行性和在人體內(nèi)的安全性，將會促進和推動基因編輯技術在臨床應用領域的發(fā)展。

如何在造血干細胞中進行高效基因編輯一直是該領域實現(xiàn)臨床應用的關鍵瓶頸。2017年，鄧宏魁研究組建立了利用CRISPR/Cas9進行人造血干細胞基因編輯的技術體系。經(jīng)過基因編輯后的人造血干細胞在動物模型中長期穩(wěn)定地重建人的造血系統(tǒng)，其產(chǎn)生的外周血細胞具有抵御HIV感染的能力，該研究成果發(fā)表在Molecular Therapy 雜志。

為了實現(xiàn)該技術在臨床上的應用，在此基礎上進行了一系列的優(yōu)化：

1）建立了能進行基因編輯造血干細胞的預處理培養(yǎng)方法；

2）通過非病毒轉染的方式將Cas9-gRNA核糖核蛋白復合體遞送進細胞，規(guī)避了外源DNA的引入；

3）縮短了Cas9在細胞內(nèi)的持續(xù)時間，從而極大的降低了脫靶效應；

4）引入了配對的gRNA策略，并對使用的gRNA進行了截短及修飾，在提高基因編輯效率的同時也降低脫靶效率。

基于此優(yōu)化技術體系，在通過原解放軍第307醫(yī)院倫理委員會審批后，該研究組進行了ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上臨床研究注冊（NCT03164135）。

該臨床試驗的病人是一位27對男性，他在2016年5月14日和5月30日分別診斷患有艾滋病和急性淋巴細胞白血病（T細胞型）。隨后立即接受抗逆轉錄病毒治療，1年后HIV感染得到控制，在血清中檢測不到病毒RNA。病人接受6個療程標準的化療治療后，其形態(tài)上達到完全緩解。供體細胞來自中華骨髓供體庫的一名33歲男性，其HLA配型完全匹配，CCR5基因沒有突變。2017年7月9日，病人在清髓后，接受異體干細胞移植。干細胞移植的細胞由兩部分組成：動員后外周血單核細胞分離出CD34+HSPCs，接受CRISPR編輯CCR5基因；剩下的單核細胞。病人同時接受抗逆轉錄病毒治療、移植物抗宿主病預防用藥。

移植治療后，13天和27天分別出現(xiàn)中性粒細胞和血小板重建；淋巴細胞和T細胞亞群增加，CD4細胞在6個月時恢復到正常范圍并穩(wěn)定；3個月時，血小板出現(xiàn)短暫減少，隨后自行恢復到正常范圍并穩(wěn)定；4周后，實現(xiàn)了完全的供體嵌合，并維持到了19個月。移植后4周，病人的急性淋巴白血病達到形態(tài)上的完全緩解，并維持到隨訪的19個月。

研究組將CCR5敲除后的供者來源的CD34+成體造血干細胞回輸?shù)交加邪籽『喜滩〉幕颊唧w內(nèi)，進行了長達兩年的移植重建及基因編輯效果的評價。

研究結果發(fā)現(xiàn)：

1）在供者來源的CD34+細胞上實現(xiàn)了17.8%的CCR5基因敲除效率；

2）移植后4周，患者白血病處于完全緩解狀態(tài)，供者型骨髓細胞嵌合率達100%；3）經(jīng)過長達19個月的隨訪發(fā)現(xiàn)，患者白血病處于持續(xù)完全緩解狀態(tài)，供者型細胞完全嵌合，骨髓細胞中能夠持續(xù)檢測到CCR5基因編輯；

4）為了初步探索治療的有效性，對該患者短暫停止服用抗HIV病毒藥物。在短暫停藥期間，CCR5基因編輯的T細胞表現(xiàn)出一定程度抵御HIV感染的能力；

5）19個月的觀察中并未發(fā)現(xiàn)基因編輯造成的脫靶及其他副作用。

這些結果表明，基于CRISPR的成體造血干細胞基因編輯技術能夠在患者體內(nèi)實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因編輯效果，經(jīng)過編輯后的成體造血干細胞能夠長期重建人的造血系統(tǒng)。

在成體造血干細胞上的基因編輯只局限在造血干細胞及其分化產(chǎn)生的血細胞中，而不會對其他組織器官及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。以CRISPR為代表的基因編輯技術在疾病的治療上具有極大的應用潛力，有望為艾滋病、鐮刀型貧血、血友病、β地中海貧血等血液系統(tǒng)相關疾病的治療帶來新的曙光。

本研究針對基因編輯安全性和有效性進行了一系列的優(yōu)化，首次在人體內(nèi)探索了基因編輯的造血干細胞移植的可行性和安全性，對于推動基因編輯技術治療多種疾病的臨床研究具有重要參考價值。在今后的研究中，進一步提高基因編輯效率及優(yōu)化移植方案，有望加速基因編輯造血干細胞移植技術向臨床疾病治療轉化進程。

該研究的共同通訊作者陳虎教授是中國造血干細胞領域的優(yōu)秀人物，在此研究中起到關鍵的作用，不幸的是陳虎教授在此論文修訂期間英年早逝。