來(lái)源：石頭道科普
蛋白質(zhì)是生命功能的最終執(zhí)行者，也是臨床診斷、疾病分型、藥物篩選等生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域重要、應(yīng)用廣的檢測(cè)對(duì)象。免疫檢測(cè)一直以來(lái)在蛋白質(zhì)檢測(cè)中占據(jù)著主導(dǎo)地位。免疫檢測(cè)技術(shù)如ELISA，CLIA等的靈敏度一般只能達(dá)到pg/mL水平。然而，在疾病早期，精確檢測(cè)這些超低豐度蛋白又對(duì)預(yù)判疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸有著重大意義，伴隨著大健康產(chǎn)業(yè)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)方法的技術(shù)瓶頸與巨大市場(chǎng)需求之間的矛盾日趨凸顯。本期推送主要介紹Digital ELISA的技術(shù)原理及產(chǎn)業(yè)化情況。
Digital PCR是目前絕對(duì)定量PCR的主要技術(shù)方式，通過(guò)對(duì)樣品的微滴化處理，使每個(gè)單元包含沒(méi)有、一個(gè)或者多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由于不需要對(duì)其擴(kuò)增曲線進(jìn)行監(jiān)控，不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來(lái)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元的平均濃度達(dá)到絕對(duì)定量的目的。
同樣的理念目前已用于開(kāi)發(fā)其它數(shù)字化檢測(cè)技術(shù)，如Digital ELISA、Digital LAMP和Digital RPA。為了實(shí)現(xiàn)更低濃度蛋白質(zhì)檢測(cè)，Quanterix采用類(lèi)似于Digital PCR的方式開(kāi)發(fā)了Digital ELISA。它們稱(chēng)這個(gè)技術(shù)為Simoa（Single-molecule Array），Simoa技術(shù)靈敏度比ELISA高1000倍以上，它的出現(xiàn)將蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)直接帶入到單分子、數(shù)字化檢測(cè)時(shí)代，成為fg級(jí)超低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)技術(shù)。
什么是Digital ELISA
Digital ELISA，也稱(chēng)為Simoa技術(shù)，與傳統(tǒng)免疫試驗(yàn)主要區(qū)別在于Simoa能夠在飛升大小的孔中捕獲單個(gè)分子，允許單個(gè)磁珠信號(hào)的數(shù)字化讀取。Simoa最早的報(bào)道源自于2010年naure biotechnology的報(bào)道。本質(zhì)上SIMOA的設(shè)計(jì)理念和Digital PCR很像。
Simoa所采用的Digital ELISA基本原理和Digital PCR類(lèi)似。為了檢測(cè)血液中的低豐度蛋白質(zhì)，Simoa用特異性抗體修飾的微珠捕獲靶標(biāo)生物標(biāo)志物，在生物標(biāo)志物濃度很少時(shí)，每個(gè)珠子能捕獲一個(gè)或零個(gè)靶蛋白質(zhì)分子，通過(guò)免疫反應(yīng)后形成免疫復(fù)合物，然后用能夠產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的酶報(bào)告信號(hào)。通過(guò)把單個(gè)珠子限定在50 fL反應(yīng)室中，使用熒光成像來(lái)檢測(cè)單個(gè)格子的熒光信號(hào)進(jìn)行最后定量。這種單分子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Digital ELISA）方法具有在100 μL樣品中檢測(cè)到少至約 10-20個(gè)酶標(biāo)記的復(fù)合物。
Digital ELISA的檢測(cè)步驟
Simoa的檢測(cè)步驟可分為捕獲、封裝、成像三步（Loading, sealing, and imaging）。
磁微粒免疫捕獲
使用直徑為2.7微米的磁珠標(biāo)記特異性抗體。通常而言，一個(gè)磁珠上有大約250000個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，保證了識(shí)別的效率。將含有500000個(gè)標(biāo)記磁珠加入到100微升樣本中，保證每個(gè)磁珠盡可能的只捕獲到一個(gè)生物標(biāo)志物，并盡可能的把所有標(biāo)志物都捕獲到。余下步驟和普通的磁微粒酶觸化學(xué)發(fā)光類(lèi)似，經(jīng)過(guò)清洗和偶聯(lián)酶聯(lián)抗體形成最后的磁微粒免疫復(fù)合物。
磁微粒的陣列封裝
Simoa使用蝶式芯片的方式將磁微粒進(jìn)行分裝并利用超靈敏熒光探針對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。這兩部分屬于Quanterix的核心技術(shù)。純化后的磁微粒免疫復(fù)合物被加入到芯片表面微孔反應(yīng)室中，由于每個(gè)微孔的尺寸（4.25微米寬，3.25微米深）只能容下一個(gè)微球，并且被硅油封閉，使得可以使用直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式得到生物標(biāo)志物的含量。
Simoa的蝶式芯片具有24路檢測(cè)通道，每個(gè)通道都含有216000個(gè)微孔陣列。通常而言，微孔的數(shù)量越多，制造難度和成本也越大，這部分應(yīng)該也屬于Quanterix的核心技術(shù)。
熒光成像和蛋白定量
圖像的獲取是通過(guò)CCD進(jìn)行成像。通過(guò)軟件控制CCD進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間曝光獲得明場(chǎng)和熒光照片，從兩幅照片中獲得熒光點(diǎn)占總顆粒的百分比進(jìn)而確定生物標(biāo)志物濃度。對(duì)于更高濃度的生物標(biāo)志物，還可以利用CCD采集模擬信號(hào)值進(jìn)行檢測(cè)，這種方法大大擴(kuò)大了其檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍。
QUANTERIX簡(jiǎn)介
2007年，Walt成立了Quanterix Corporation。公司總部位于美國(guó)馬薩諸塞州，規(guī)模很小，只有數(shù)十名員工。不過(guò)，Quanterix自主研發(fā)的單分子免疫陣列技術(shù)（SiMoA）是目前商業(yè)化產(chǎn)品中最靈敏的免疫分析方法，還已經(jīng)具備多重檢測(cè)能力。
Quanterix公司一直致力于數(shù)字化的蛋白標(biāo)志物研究，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展。其核心技術(shù)是 simoa (single molecular array)，即單分子陣列技術(shù)，科學(xué)創(chuàng)始人之一是美國(guó)工程院和醫(yī)學(xué)院院士David R. Walt教授（illumina創(chuàng)始人之一）。2017年12月在美國(guó)納斯達(dá)克上市(nasdaq: qtrx)。
Quanterix推出的儀器都是基于simoa技術(shù)，simoa可實(shí)現(xiàn)單個(gè)分子檢測(cè)，靈敏度達(dá)到飛克級(jí)別（fg/ml），比傳統(tǒng)elisa方法靈敏度高出1000 倍。應(yīng)用于腫瘤，神經(jīng)、心血管、感染性疾病和免疫炎癥等領(lǐng)域蛋白標(biāo)志物檢測(cè)，以及mirna檢測(cè)。
Walt博士不僅是Quanterix科學(xué)顧問(wèn)委員會(huì)的科學(xué)創(chuàng)始人和主席，其也是基因測(cè)序龍頭企業(yè)Illumina的創(chuàng)始人兼董事。他是塔夫茨大學(xué)的羅賓遜化學(xué)教授和霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的教授。Walt博士是美國(guó)國(guó)家工程院院士，美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)成員，美國(guó)醫(yī)學(xué)和生物工程研究所研究員。Walt博士是多個(gè)期刊的編輯顧問(wèn)委員會(huì)成員，包括分析化學(xué)，分析和生物分析化學(xué)，傳感器快報(bào)和印度生物技術(shù)雜志。
產(chǎn)業(yè)化情況
目前Quanterix有多種通量的儀器以滿足不同的應(yīng)用需求，其中最出名的是Simoa HD-1。具體檢測(cè)性能和儀器參數(shù)如下所示。
檢測(cè)性能
參數(shù) | Simoa HD-1 |
靈敏度 | 比現(xiàn)有的常規(guī)免疫檢測(cè)平均高1000倍以上 |
動(dòng)態(tài)范圍 | >4 logs |
精準(zhǔn)度 | <10% CVs |
儀器參數(shù)
參數(shù) | Simoa HD-1 |
通量 | 68個(gè)檢測(cè)／小時(shí) >500個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)／天 |
工作流程 | 批處理（96孔板或樣本管） |
總檢測(cè)時(shí)間 | <2.5小時(shí)／96孔板 |
手工操作時(shí)間 | 準(zhǔn)備時(shí)間<20分鐘 |
自動(dòng)化 | 全自動(dòng)（從樣本進(jìn)入到數(shù)據(jù)產(chǎn)出） |
上樣 | 96孔板或樣本管 |
上樣體積 | 1ml*-100ml |
儀器空間 | 135×60×160cm，落地式 |
多重分析能力 | 一個(gè)樣本10重檢測(cè) |
目前Simoa的商品化試劑盒已經(jīng)覆蓋腫瘤、神經(jīng)、心血管、免疫等。通過(guò)Simoa可以直接對(duì)血清和血漿中蛋白、miRNA等標(biāo)志物進(jìn)行超高靈敏度檢測(cè)，極大的推動(dòng)腫瘤、神經(jīng)、感染性疾病和免疫炎癥，特別是癌癥的早期檢測(cè)，術(shù)后的檢測(cè)和精準(zhǔn)用藥。國(guó)內(nèi)杭州紐藍(lán)科技有限公司是Quanterix中國(guó)區(qū)總代理。2018年，佰美基因和Quanterix合作成立佰美-Quanterix中國(guó)合作研究中心。
具體的檢測(cè)項(xiàng)目如下所示
