作者：吳玙彤，謝麗麗

導(dǎo)語：尼帕病毒病(NVD) 是由尼帕病毒引起的一種新的人畜共患病毒性疾病，于1997 年在馬來西亞森美蘭洲雙溪尼帕城首次發(fā)現(xiàn)，是繼瘋牛病、口蹄疫、禽流感后又一引起世界各國廣泛關(guān)注和恐慌的人畜共患病。生豬感染該病毒后，出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難及腦炎癥狀；母豬感染該病毒后表現(xiàn)為共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀，可能會導(dǎo)致流產(chǎn)或突然死亡；人感染該病毒后發(fā)生病毒性腦炎而死亡。由于其引起人感染后的高死亡率，缺乏有效的疫苗和治療方法，因此世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 和我國農(nóng)業(yè)部都將其列為生物安全4 級病原體。

尼帕病毒病是由副黏病毒科亨尼帕病毒屬(Henipavi rus) 的尼帕病毒(NiV) 引起的一種人畜共患傳染病。NiV 是新發(fā)現(xiàn)于蝙蝠的一種副黏病毒，1999 年3 月初， 從Sungai Nipah 村1名腦炎患者的腦脊液中分離到了一種新的副黏病毒，并確定為該次暴發(fā)的病原，因此命名為尼帕病毒(Nipah virus)。血清學(xué)檢測顯示，家養(yǎng)動物如狗、貓、馬和山羊均可感染尼帕病毒，但豬是其他家養(yǎng)動物的傳染源。尼帕病毒可感染不同年齡的豬，從1998 年馬來西亞暴發(fā)尼帕病毒病以來，已造成許多人和豬傷亡，引起了巨大的社會恐慌，并給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

2.1 病原學(xué)檢測

2.1.1 NiV 分離鑒定

NiV 能夠在多種培養(yǎng)細胞中生長并快速增殖至較高的滴度。非洲綠猴腎細胞和兔腎細胞RK-13 細胞系對NiV 尤為敏感。通常在病毒感染3 d 內(nèi)能夠觀察到病毒病變效應(yīng)(CPE)，但一般來說在細胞上傳代2 次，每次5 d 所達到的分離效果更為穩(wěn)定。經(jīng)低毒量穩(wěn)定傳代后的病毒再次感染細胞后24 ～ 48 h，細胞出現(xiàn)以形成合胞體為特征的CPE，并且感染早期，合胞體中所有細胞核位于合胞體中央，而晚期則被運送至合胞體外，并聚集在其周圍。由于NiV 在體外細胞培養(yǎng)中擴增迅速，并且能產(chǎn)生大量的病毒抗原，所以采用免疫熒光或免疫電鏡法檢測分離培養(yǎng)該病毒，最為方便快速。

2.1.2 分子診斷技術(shù)

NiV 的基因組全序列已被測出，研究者們可以在此基礎(chǔ)上針對NiV 的分子診斷技術(shù)進行相應(yīng)的研發(fā)。目前，已經(jīng)被報道的針對NiV 的分子檢測技術(shù)有2 種，分別為熒光定量RT-PCR和雙重套式RT-PCR。

2.1.2.1 熒光定量RT-PCR

該方法敏感度高、特異性強，并且不需要接觸活的感染性病毒，具有生物安全性的優(yōu)勢。其檢測靈敏度可以達到 1 個空斑形成單位（ PFU），并且有被學(xué)術(shù)界普遍認可的相關(guān)引物和探針有：

5′－ TCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTAA －３′（Primer1），

５ ′ － CCCCTTCATCGATATCTTGATCA －３′（Primer2），

５′－6FAM－CCTCCAATGAGCACACCTCCTGCAGTAMRA －３ ′（TaqMan probe）， 為NiV 的實驗室快速診斷提供了技術(shù)支持。

2.1.2.2 雙重套式RT-PCR ：

Wacharapluesadee 等描述了一種帶有內(nèi)參的雙重套式RT-PCR 檢測技術(shù)。該技術(shù)能夠用于對果蝠尿樣的檢測，并且加入內(nèi)參大大降低PCR 相關(guān)的抑制因素帶來的假陰性的結(jié)果，提高檢出準(zhǔn)確率，在NiV 流行病學(xué)調(diào)查時大大提高NiV 監(jiān)測數(shù)據(jù)的可靠性。

2.1.3 其他診斷技術(shù)

主要針對NiV 全病毒抗原或病毒主要致病抗原（如F 蛋白和G 蛋白等）制備特異性的病毒抗血清或單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立病毒中和試驗、免疫組化以及免疫熒光等方法檢測NiV相關(guān)抗原。病毒中和試驗主要包括傳統(tǒng)的空斑抑制試驗、微孔板中和試驗以及免疫空斑試驗3 種，分別通過計算空斑形成單位（PFU）、組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）以及病灶形成單位（FFU）達到檢測病毒抗原或抗體的目的。檢測NiV 的病毒中和試驗需要在BSL4 級生物實驗室進行，但近年來研究者們陸續(xù)開發(fā)了幾種實驗室檢測技術(shù)，能夠?qū)z測NiV 的生物安全水平降低至BSL2 級，為偏遠地區(qū)NiV 檢測提供了幫助。由于NiV 原發(fā)于血管內(nèi)壁，所以病死畜的多個器官均可用于免疫組化的檢測，尤其是肺臟。

目前，研究者們已經(jīng)針對NiV 的免疫組化法檢測研發(fā)了幾個檢測體系，為該病毒的實驗室檢測提供了技術(shù)支持。

2.2 血清學(xué)檢測

鑒于NiV 的生物危害性，用于該病毒血清學(xué)診斷的所有血清樣品必需進行安全化處理，以盡量減少實驗室工作人員接觸NiV 的風(fēng)險?？梢杂? kGy的γ 射線輻照或含0.05% Tween20和0.5% Triton—X100 PBS（磷酸緩沖液） 1/5 稀釋后56 ℃ 30 min 滅活的方法對血清樣品進行前處理。目前常用的NiV 的血清學(xué)檢測方法包括病毒中和試驗和ELISA 試驗。

2.2.1 病毒中和試驗

目前針對NiV 抗體檢測的病毒中和試驗已經(jīng)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法，Kaku等人利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了共表達NiV F 或G 蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的重組水泡性口炎病毒，作為已知病毒抗原檢測NiV 血清樣本，用該重組病毒作為已知病毒抗原的好處在于GFP是可見的，可以在熒光顯微鏡下直觀地數(shù)出熒光斑點的數(shù)量而獲知血清樣品中NiV 特異性抗體的含量。該方法要比傳統(tǒng)的中和試驗更為迅速、安全和靈敏。Tamin 同樣也利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了單獨表達F 或G 蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原，檢測NiV 抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測NiV 抗體的空斑抑制試驗。

2.2.2 ELISA

目前， 針對NiV 抗體檢測的ELISA 技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出間接ELISA 和捕獲ELISA 2 種。Daniels 在1999 年召開的國際豬病監(jiān)測會議中提出了一種用非離子去污劑處理NiV 感染的細胞以獲得ELISA 檢測用NiV 抗原的方法，隨后，為消除ELISA 的非特異性，研究者們又在此基礎(chǔ)上加入了非感染細胞作為對照。美國疾病控制中心開發(fā)出能夠檢測針對NiV IgG 和IgM 2 種亞型免疫球蛋白的ELISA 技術(shù)。此外，Yu 等人也報道過用NiV N 蛋白作為病毒抗原檢測IgG 和IgM 2 種亞型免疫球蛋白的ELISA 方法。

目前對該病尚無有效的藥物和治療方法，只能采取強制措施，監(jiān)測并淘汰患病動物，以免傳染給人；防止家豬與野豬的接觸；禁止運輸和進口患病豬及其肉制品；對豬舍進行消毒，搞好清潔衛(wèi)生工作。人感染后，用廣譜抗病毒藥Ribavirin( 利巴韋林)，可減少發(fā)燒時間，緩解發(fā)病程度，降低急性腦炎死亡率。隨著科學(xué)家對這一病原的不斷了解，人們利用皰疹病毒為載體進行F、G 融合蛋白克隆，并在大腸桿菌中進行表達，有可能用來防治尼帕病毒的感染，其他相關(guān)的疫苗正在研究開發(fā)中。

本文選自《豬業(yè)科學(xué)》2015年第11期 “豬群保健”欄目中P106-107

（版權(quán)歸《豬業(yè)科學(xué)》所有，如轉(zhuǎn)載，請注明出處）