AAV載體是目前基因治療研究中常用的載體之一。Asklepios BioPharmaceutical（AskBio）是一家專注于AAV基因療法開發(fā)的公司，擁有豐富的AAV衣殼庫和規(guī)?；疨ro10生產(chǎn)工藝，其正在推進(jìn)AAV基因療法在臨床上的應(yīng)用。

致力于開發(fā)基因療法的AskBio

Asklepios BioPharmaceutical（AskBio）

Asklepios BioPharmaceutical（AskBio）的命名源自希臘神話中的天醫(yī)—Asclepius，他治愈了許多不治之癥，被視為醫(yī)學(xué)之神。

秉承著治療難治性疾病的宗旨，AskBio致力于AAV基因療法的開發(fā)，為臨床上治療血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥及巨軸神經(jīng)病變（GAN）等難治性遺傳病提供新的治療選擇。

AskBio的聯(lián)合創(chuàng)始人—Richard Jude Samulski

AskBio成立于2001年，其聯(lián)合創(chuàng)始人之一是Dr. Richard Jude Samulski，是第一位克隆出AAV基因組并將其用于治療目的科學(xué)家。

Dr. Samulski深耕AAV領(lǐng)域長達(dá)40年之久，AskBio的成立得益于他在北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校對(duì)AAV作為基因療法載體的研究。Dr. Samulski的研究推進(jìn)了AAV基因療法在臨床上的應(yīng)用。

AskBio的Capsid&vector技術(shù)

AAV是一種無包膜DNA病毒，外包衣殼蛋白，根據(jù)衣殼蛋白抗原的不同，AAV可以分為多個(gè)血清型，不同血清型的AAV具有不同的組織細(xì)胞靶向性。

AAV的基因組為單鏈線狀DNA（single strand DNA, ssDNA），兩末端為反向末端重復(fù)序列（ITR），是AAV復(fù)制和包裝所必需的作用元件。在ITR之間為Rep和Cap基因，編碼病毒的衣殼蛋白。

臨床上應(yīng)用的AAV治療載體僅保留了AAV的ITR，而將Rep和Cap基因以目的基因表達(dá)框替代。

AskBio的AAV技術(shù)可以對(duì)病毒的衣殼蛋白（Capsid）或基因組（vector）進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)特定疾病的新型AAV載體，為臨床上治愈或減輕難治性疾病的癥狀提供可能。

雙鏈AAV載體（Self-Complementary Vectors）

AAV感染細(xì)胞后，其ssDNA不能直接作為轉(zhuǎn)錄的模板，需要進(jìn)一步合成雙鏈DNA，才能實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。該步驟通常被認(rèn)為是AAV介導(dǎo)外源基因表達(dá)的主要限速步驟。

Dr. Samulski等通過基因工程手段，對(duì)AAV病毒的基因組進(jìn)行了改造，得到了雙鏈AAV載體（也稱自身互補(bǔ)載體，self complementary vectors）。該類AAV載體感染細(xì)胞后可以立即轉(zhuǎn)錄，因此能夠有效地解決速率限制的問題。

針對(duì)該技術(shù)，2001年5月31日北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校遞交了涉及雙鏈細(xì)小病毒載體的國際申請(qǐng)PCT/US2001/017587。

PCT/US2001/017587對(duì)應(yīng)的美國專利US7465583B2涉及一種向哺乳動(dòng)物施用核酸的方法，包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞與細(xì)小病毒顆粒接觸。該細(xì)小病毒載體的基因組在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠通過鏈內(nèi)堿基配對(duì)形成雙鏈分子。

以US7465583B2為基礎(chǔ)，北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校遞交了一系列的分案和延續(xù)案申請(qǐng)，其中分案US7790154B2保護(hù)一種細(xì)小病毒顆粒，包含細(xì)小病毒衣殼蛋白和載體基因組，其中載體基因組從5’到3’方向上包含5’細(xì)小病毒末端重復(fù)、第一異源核苷酸序列、修飾的細(xì)小病毒末端重復(fù)、單獨(dú)的異源核苷酸序列和3’細(xì)小病毒末端重復(fù)，其中第一和第二異源核苷酸序列基本上是自身互補(bǔ)的。

嵌合AAV衣殼技術(shù)（Chimeric Capsids）

AAV載體的靶向性依賴于其衣殼蛋白與細(xì)胞表面受體的相互作用。AskBio的嵌合技術(shù)通過對(duì)天然存在的AAV衣殼蛋白進(jìn)行修飾，構(gòu)建了AAV變體衣殼庫，可以介導(dǎo)特定組織外源基因的高效遞送，而且得到的嵌合AAV載體可以逃避體內(nèi)免疫系統(tǒng)中抗AAV抗體的攻擊。

參見：AskBio官網(wǎng)

針對(duì)該嵌合衣殼蛋白技術(shù)，北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校遞交了多項(xiàng)專利申請(qǐng)對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。

如PCT/US2016/066466對(duì)應(yīng)的中國專利申請(qǐng)CN108602859A的權(quán)利要求1為：

涉及一種修飾的細(xì)小病毒衣殼蛋白，該申請(qǐng)?zhí)幱趯彶殡A段，尚未獲得授權(quán)。

依托該嵌合衣殼蛋白技術(shù)，AskBio開發(fā)出了多種類型的嵌合AAV載體，如雙糖鏈?zhǔn)荏w嵌合載體等。

雙糖鏈?zhǔn)荏w嵌合載體

在大多數(shù)情況下，一類AAV主要利用一種聚糖結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如AAV2和AAV3依賴硫酸乙酸肝素（HS）；AAV4和AAV5依賴唾液酸（Sia）；AAV9依賴半乳糖（Gal）。其中比較特殊的是AAV6，它可以識(shí)別Sia和HS，但研究發(fā)現(xiàn)僅Sia是AAV6轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。

AskBio通過對(duì)AAV衣殼蛋白的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變，獲得可以識(shí)別不同聚糖的AAV載體，這類嵌合AAV載體可以通過不同的聚糖受體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。

2013年，北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校遞交了涉及雙重聚糖結(jié)合AAV載體的國際申請(qǐng)PCT/US2014/028545。

PCT/US2014/028545進(jìn)入中國國家階段的專利申請(qǐng)CN105163764A的權(quán)利要求1為：

請(qǐng)求保護(hù)一種AAV衣殼蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，所述取代將新的聚糖結(jié)合位點(diǎn)引入AAV衣殼蛋白內(nèi)。

CN105163764A的同族美國專利已經(jīng)獲得專利權(quán)（US10077291B2）。US10077291B2的權(quán)利要求1保護(hù)一種AAV2的衣殼蛋白，限定了引入AAV2衣殼蛋白上的氨基酸突變。

US10077291B2的權(quán)利要求3保護(hù)一種AAV8衣殼蛋白，限定了引入AAV8衣殼蛋白上的氨酸突變。

AskBio的研發(fā)管線

AskBio專有的Pro10^TM是通用的AAV規(guī)?；a(chǎn)系統(tǒng)，為一種適應(yīng)懸浮生長的HEK293細(xì)胞系。Pro10^TM生產(chǎn)的AAV病毒載體的滴度可達(dá)10¹⁷，該生產(chǎn)能力可以支持長期臨床開發(fā)的需求。

目前AskBio正在進(jìn)行多個(gè)領(lǐng)域疾病AAV基因療法的開發(fā)。如由AskBio拆分出的Actus Therapeutics和NanoCor Therapeutics分別負(fù)責(zé)研發(fā)的ACTUS-101和Carfostin。

參見：AskBio官網(wǎng)

ACTUS-101

ACTUS-101是Actus Therapeutics負(fù)責(zé)研發(fā)的針對(duì)龐貝?。≒ompe）的AAV基因療法，通過靜脈注射輸注轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟細(xì)胞。

Pompe是由肌肉中酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）缺乏引起糖原在組織器官尤其是肌肉中積累的遺傳病，常導(dǎo)致過早死亡，目前尚無有效的治療方案。預(yù)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ACTUS-101可以在體內(nèi)細(xì)胞中連續(xù)生產(chǎn)GAA。

目前，Actus正在開展ACTUS-101針對(duì)Pompe的1/2期臨床研究。

Carfostin

Carfostin是NanoCor Therapeutics負(fù)責(zé)研發(fā)的針對(duì)充血性心力衰竭（CHF）的AAV基因療法，通過股動(dòng)脈輸送至冠狀動(dòng)脈感染受損的心肌細(xì)胞。

CHF往往是心臟病的最后階段，表現(xiàn)為心肌僵硬，心臟無法向身體提供足夠量的血液和氧氣。Carfostin能將蛋白磷酸酶1抑制劑遞送至受損的心臟細(xì)胞中并且靶向1型蛋白磷酸酶，后者是鈣循環(huán)和心肌細(xì)胞收縮的負(fù)調(diào)節(jié)劑。

結(jié)語

除NanoCor和Actus外，AskBio還成功拆分出Bamboo Therapeutics和Chatham Therapeutics。前者專注于杜氏肌營養(yǎng)不良AAV基因療法的開發(fā)（2016年AskBio將其出售給輝瑞）；后者專注于血友病的AAV基因療法的開發(fā)（2014年AskBio將其出售給Baxter）。

AskBio擁有開發(fā)AAV基因療法的技術(shù)優(yōu)勢(shì)及專利組合，當(dāng)某個(gè)候選藥物具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值后，AskBio通過拆分出專門的生物技術(shù)公司，向其提供技術(shù)支持及許可相關(guān)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)來促進(jìn)產(chǎn)品的研發(fā)。

AskBio將知識(shí)產(chǎn)權(quán)與業(yè)務(wù)運(yùn)營區(qū)分開來的模式可以提高管理效率，使其成為制藥和生物技術(shù)公司極具吸引力的合作伙伴。

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