前不久，藥明健康大會(huì)上進(jìn)行個(gè)有意思的討論：醫(yī)藥界的下一個(gè)顛覆在哪里？有幾個(gè)嘉賓都提到基因編輯會(huì)是下一個(gè)產(chǎn)生顛覆的技術(shù)，基因療法將會(huì)有所突破。

從去年開始，基因療法的資本領(lǐng)域持續(xù)升溫，新基90億美元收購Juno，賽諾菲116億美元收購Bioverativ，諾華87億美元收購AveXis，羅氏43億美元收購Spark；百健8億美元并購Nightstar。

前FDA局長Scott Gottlieb近期也發(fā)表聲明，目前FDA已經(jīng)累計(jì)接收了超過800份細(xì)胞或基因療法的IND申請。預(yù)計(jì)到2020年，每年將接收超過200份IND申請。預(yù)計(jì)到2025年，FDA每年將會(huì)批準(zhǔn)10-20個(gè)細(xì)胞和基因療法產(chǎn)品。

種種跡象表明，基因療法臨界燃點(diǎn)了，要火?。⌒』锇閭兯奶幈甲呦喔?，都要上車？急啥啊，筆者的基因療法干貨篇得認(rèn)真讀完啊。

筆者既不打算追溯到1963年，從Joshua Lederberg第一次提出了基因交換和基因優(yōu)化的理念開始說起，也不打算跟大伙瞎聊CRISPR技術(shù)晦澀的作用原理，筆者只想幫大家理清基因療法的種類、如今的臨床進(jìn)展和筆者的一些思考（因?yàn)楣P者也只是基因療法小白）。

開篇前提示一下：本篇寫的基因療法是泛指，不僅僅是利用CRISPR技術(shù)對特定DNA片段的敲除和加入，也包含利用病毒載體轉(zhuǎn)入基因療法（包含CAR-T和溶瘤病毒）、小核酸類藥物的療法，但不囊括小分子作用RNA領(lǐng)域或作用表觀遺傳學(xué)的部分，如下圖所示。

一、基因療法的分類：傻傻分不清楚？

siRNA？microRNA? ASOs? mRNA？RNAa? CRISPR?這都是啥啥啥？都認(rèn)識(shí)，那shRNA和piRNA還認(rèn)識(shí)嗎？（認(rèn)全的可以私下加我，同樣是九年義務(wù)教育，你簡直太優(yōu)秀了?。?/p>

看不懂吧？來，聽我說（chui）。

※ “缺啥補(bǔ)啥”的mRNA和基因轉(zhuǎn)入

★ mRNA又叫信使RNA（Messenger RNA），是通過DNA轉(zhuǎn)錄而來，攜帶遺傳信息，能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。那么mRNA療法又是啥呢？舉個(gè)栗子：甲基丙二酸血癥/酸尿（MMA）是一種破壞性的代謝性疾病，發(fā)病機(jī)制是由甲基丙酰輔酶A變位酶（MUT）完全（mut0）或部分（mut）缺乏所導(dǎo)致，大白話就是體內(nèi)沒酶了，咋辦呢？補(bǔ)酶唄！那咱吃酶行嗎？光吃，也不吸收啊，沒法給咱干活了。那就補(bǔ)點(diǎn)mRNA,讓它指導(dǎo)翻譯，多合成點(diǎn)酶，這樣就齊活了。近期的生物板塊最大IPO公司BioNTech和Moderna Therapeutics就是干這事的。而基因轉(zhuǎn)入療法的設(shè)計(jì)原則也類似，區(qū)別是病毒載體上裝載的是cDNA基因，需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯才能生產(chǎn)指定的蛋白質(zhì)，比mRNA療法多了一環(huán)節(jié)。

※ 基因沉默的“三劍客”—siRNA、ASOs、miRNA

★ siRNA又稱小干擾RNA（Small interfering RNA），通常是一段長21個(gè)核苷酸的雙股RNA（dsRNA，非內(nèi)源，人工合成），作用是與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA進(jìn)行沉默（降解）。那siRNA療法是個(gè)啥呢？舉個(gè)例子：hATTR多發(fā)性神經(jīng)病患者是指遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的周圍神經(jīng)疾病。通俗的講，患者是由于異常形式TTR過多而導(dǎo)致，那么我們?nèi)绾螠p少這些異常TTR形成呢？拿塞子堵住行不行呢？那當(dāng)然不行了，我們只需要用給患者體內(nèi)注入siRNA（Alnylam 公司開發(fā)的Onpattro）來沉默TTR的RNA即可，這樣就可以減少周圍神經(jīng)中淀粉樣沉積物的積累。

★ ASOs: 反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides), 是指與靶基因mRNA互補(bǔ)的一段單鏈DNA或RNA序列，通常由十幾到幾十個(gè)堿基組成通過化學(xué)合成的方式生產(chǎn)。其作用機(jī)制是也是導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻譯。ASOs療法原理其實(shí)跟siRNA一樣，都是沉默目標(biāo)mRNA，使得致病蛋白表達(dá)水平降低，從而達(dá)到治療的效果。

★ miRNA（microRNA）:是一種小的內(nèi)源性非編碼是一種大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA, 通過與靶基因mRNA的配對，促進(jìn)mRNA的降解或抑制其翻譯，作用跟ASOs類似。那什么是miRNA療法呢？比如，mir-103/107基因在肥胖小鼠模型及NASH患者的肝臟中表達(dá)量明顯上調(diào)，研究者用RG-125，（一種N-乙酰半乳糖胺修飾的反miR 103/107 低聚核苷酸）通過解除miR 103/107對相關(guān)mRNA的抑制，即可治療糖尿病或者NASH了。

※ 基因激活的“一枝花”—RNAa

★ RNAa：RNA激活（RNA activation），由靶向特定的基因啟動(dòng)子DNA區(qū)域的雙鏈小RNA（dsRNA）分子介導(dǎo)。這類針對基因非編碼區(qū)的dsRNA被稱為agRNA（antigene RNA）, 其中能誘導(dǎo)RNAa現(xiàn)象（激活基因表達(dá)）的agRNA被稱為small activating RNA （saRNA）。RNA激活療法，顧名思義就是通過基因轉(zhuǎn)錄水平激活內(nèi)源性基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的，比如通過RNAa激活人體內(nèi)抑癌基因，從而達(dá)到抑癌的效果。

上面提了這么多的小核酸藥物，就不能不問，全國核酸哪家強(qiáng)，還得看我大昆山。順便植入一則小廣告，想產(chǎn)業(yè)落戶的，項(xiàng)目咨詢的都?xì)g迎來撩。

※ “神奇剪刀手”—CRISPR

★ CRISPR：（成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），是一種基因編輯技術(shù)，在向?qū)NA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞目標(biāo)基因組DNA可以被精確剪切。隨后生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)模式：會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除；同源定向修復(fù)（HDR）模式：如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒（供體DNA分子），這樣細(xì)胞就會(huì)按照提供的模板在修復(fù)過程中引入片段插入，這樣就可以實(shí)現(xiàn)基因的替換和插入。

以上的基因療法分類主要是從技術(shù)原理來劃分，當(dāng)然基因療法也可以從產(chǎn)生作用的方式來劃分，比如：

1) 體外基因編輯或轉(zhuǎn)入：治療原理是體內(nèi)的某些功能細(xì)胞因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致功能喪失，把這些喪失功能的細(xì)胞取出來，進(jìn)行基因編輯或者基因?qū)耄顾鼈儷@得正常的細(xì)胞功能，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，即可完成治療。比如：β-地中海貧血屬于常染色體隱性遺傳病，其編碼β-珠蛋白的基因異常使β珠蛋白的合成減少或不能合成，α-珠蛋白大量積累，導(dǎo)致血紅蛋白的組分改變，進(jìn)而引發(fā)紅細(xì)胞壽命縮短。β-地中海貧血的離體 (Ex Vivo)基因治療過程主要包括：先收集病人的造血干細(xì)胞；再使用BB305將正常的β-珠蛋白基因?qū)肫渲?，使?xì)胞功能恢復(fù)正常；最后將改造后的造血干細(xì)胞回輸給病人。另外，目前火熱的CAR-T也是類似的治療思路。

2) 體內(nèi)生效：體內(nèi)基因轉(zhuǎn)入或者遞送。對于一些基因突變導(dǎo)致的功能蛋白減少，或者異常蛋白增多，我們可以采用病毒載體（AAV）或者非病毒載體（脂質(zhì)體或）將mRNA、siRNA、ASOs、miRNA的抑制劑、或者是正?；蜻f送到相關(guān)細(xì)胞中，采用這類的載體攜帶的基因通常不整合到基因組中，目的基因會(huì)稀釋，因此需要長期給藥。比如2016年批準(zhǔn)的Spinraza，2017年批準(zhǔn)的LUXTURNA等。

3) 體內(nèi)編輯：主要是CRISPR技術(shù)，基因編輯技術(shù)可以對目標(biāo)基因進(jìn)行刪除、矯正和添加。比如：張鋒的Editas Medicine公司，EDIT-101將編碼Cas9的基因和兩個(gè)指導(dǎo)RNA（gRNA ）裝載進(jìn)AAV5病毒載體。通過視網(wǎng)膜下注射直接注射到患者感光細(xì)胞附近，將基因編輯系統(tǒng)遞送到感光細(xì)胞中。當(dāng)感光細(xì)胞表達(dá)基因編輯系統(tǒng)時(shí)，gRNA指導(dǎo)的基因編輯可以消除或逆轉(zhuǎn)CEP290基因上致病的IVS26突變，從而改善感光細(xì)胞功能，為Leber先天性黑朦10型患者患者帶來臨床益處。

二、基因療法的研發(fā)進(jìn)展

1、基因療法臨床數(shù)量有幾何？

根據(jù) The journal of gene medicine的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截止到2019年之前，基因療法的臨床試驗(yàn)高達(dá)2930例，主要還是分布在I期和II期中。這里需要注意的是同樣的項(xiàng)目可以開幾個(gè)臨床試驗(yàn)，也可以針對很多適應(yīng)癥，因此實(shí)際的基因療法項(xiàng)目其實(shí)沒有2千多個(gè)。各試驗(yàn)分布階段如下：

2、基因療法治療哪些適應(yīng)癥？

目前的基因療法臨床試驗(yàn)還是仍以腫瘤為主占66.6%（包括CAR-T和溶瘤病毒），其次是單基因遺傳病11.5%，感染疾病6.3%，心血管疾病6.2%，神經(jīng)系統(tǒng)1.8%等。筆者認(rèn)為，基因療法目前在遺傳基因缺陷、神經(jīng)系統(tǒng)和眼科疾病取得了突破性成就。一方面得益于病因的生理學(xué)基礎(chǔ)，另一方面得益于基因療法遞送系統(tǒng)的創(chuàng)新。各試驗(yàn)適應(yīng)癥統(tǒng)計(jì)比例如下：

3、基因療法使用哪些載體？

其實(shí)狹義講的基因療法， FDA直到2017年才批準(zhǔn)第一個(gè)。困擾基因療法前進(jìn)最大的問題就是載體遞送系統(tǒng)。載體系統(tǒng)需要安全性、免疫原性、轉(zhuǎn)染效率、組織靶向等幾大方面的考量。目前基因療法使用的載體分兩大種（當(dāng)然也有不需要載體的），一種是病毒載體；另一種是非病毒載體。

A、病毒載體

常用的是逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒這兩種病毒屬于整合型病毒，可以將攜帶的基因插入到宿主細(xì)胞的基因組中，具有感染效率高、感染細(xì)胞廣、但同時(shí)也存在病毒毒性、免疫原性、基因插入突變等許多問題。

另一種病毒載體常用的是腺相關(guān)病毒（AAV），它是屬于非整合型病毒，不改變宿主細(xì)胞的基因組，因此不存在基因插入突變的相關(guān)問題。同時(shí)AAV還具有一個(gè)非常獨(dú)特的優(yōu)勢，它通常具有組織靶向性： 目前科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十幾種腺相關(guān)病毒亞型，不同亞型的病毒對不同組織細(xì)胞有不同的親和性，從而部分解決了病毒載體組織細(xì)胞靶向性的問題。例如，最常用的血清 2型腺相關(guān)病毒（AAV2）對骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元、細(xì)胞平滑肌細(xì)胞和肝細(xì)胞具有高親和性。但AAV病毒也有兩個(gè)主要的缺陷，可攜帶的目的基因片段較小： 逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶目的基因的容量通常在 8Kb 左右，而腺相關(guān)病毒僅為 4.5Kb；此外目的基因易被稀釋： 腺相關(guān)病毒基因組以游離 DNA 的形式存在于宿主細(xì)胞，并不插入宿主基因組中，因此在宿主細(xì)胞發(fā)生分裂增殖時(shí)，病毒載體導(dǎo)入的“補(bǔ)償基因”并不會(huì)隨著宿主 DNA的復(fù)制而復(fù)制。當(dāng)宿主細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞后，目的基因的數(shù)量也會(huì)被稀釋，最終逐漸丟失，故而腺相關(guān)病毒在感染長期存活的非分裂細(xì)胞或分裂次數(shù)較少的細(xì)胞時(shí)優(yōu)勢較為明顯。

基因療法常見的病毒載體參數(shù)介紹對比如下：

B、非病毒載體（主要包括裸露DNA、脂質(zhì)體、納米載體等）

★ 脂質(zhì)體：脂質(zhì)納米粒（LNP）導(dǎo)入技術(shù)。

★ 多肽納米材料（圣諾的技術(shù)）。

★ 聚乙烯亞胺（PEI）。

★ GalNAc（N-乙酰-D-半乳糖胺）的化學(xué)修飾，肝靶向效果很好，而且不必靜脈注射、皮下給藥即可。

★ 流式電穿孔技術(shù)： 2018年11月，MaxCyte授權(quán)Kite非獨(dú)家使用流式電穿孔技術(shù)（flow electroporation），這一無需使用病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞工程技術(shù)的首次協(xié)議。

4、國內(nèi)外基因療法上市的有哪些？

截止到目前，主流藥物市場反義核苷酸共上市8個(gè)，基因轉(zhuǎn)入（4），siRNA（1），溶瘤病毒（2），CAR-T（2）。從狹義上定義的基因療法，全球首個(gè)基因藥物其實(shí)是來自中國的“今又生”，是不是很驚喜，很意外？

★ 1998年FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)反義核苷酸藥物Fomivirsen，用于AIDS 病人并發(fā)的 CMV 視網(wǎng)膜炎的二線治療藥物。

★ 2003年中國CFDA批準(zhǔn)了第一個(gè)基因治療藥物，重組人p53腺病毒注射液“今又生”。

★ 2004年中國CFDA批準(zhǔn)了首個(gè)溶瘤病毒“安柯瑞”，用于治療頭頸癌。

★ 2012年歐盟批準(zhǔn)了首個(gè)基因轉(zhuǎn)入藥物Glybera，用于治療脂蛋白酶缺乏癥。

★ 2015年FDA批準(zhǔn)了首個(gè)溶瘤病毒藥物Imlygic，用于治療黑色素瘤。

★ 2017年FDA批準(zhǔn)了首個(gè)CAR-T療法，Kymriah，用于 治療血液瘤。

★ 2018年FDA批準(zhǔn)了首個(gè)siRNA療法Patisiran，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。

已上市的基因療法統(tǒng)計(jì)如下：

截止目前，ASOs、siRNA,基因轉(zhuǎn)入、溶瘤病毒、CAR-T都已經(jīng)有上市的藥物，而RNAa、microRNA、mRNA、基因編輯都還在臨床試驗(yàn)中，仍還奔赴上市的路上。

三、基因療法—熱投資下的“冷思考”？

由基因缺陷引起的疾病多達(dá)7000余種，這些亟待我們?nèi)ソ鉀Q，同時(shí)基因療法也在不斷的擴(kuò)展新的疾病領(lǐng)域。從癌癥、到神經(jīng)系統(tǒng)疾病、多種罕見病，基因療法頻頻傳出捷訊。資本也蜂擁而至，紛紛搶占高地。但越是在熱鬧的時(shí)候，進(jìn)行冷靜的思考，才有助于我們更加清醒的認(rèn)清事物發(fā)展規(guī)律，把握未來發(fā)展方向。

★ 一次性治愈的的基因編輯技術(shù)將會(huì)顛覆未來嗎？

相對于多種小核酸藥物或者基因?qū)敕椒?，大多還是需要長期的接受治療，暫緩病情，還未到終身治愈的效果。以治療hATTR為例的兩個(gè)基因療法，反義RNA （Tegsedi）vs RNAi（Onpattro）為例，療效和安全數(shù)據(jù)方面，Onpattro比Tegsedi都更勝一籌。但Onpattro仍需要每三周靜脈注射一次。目前來看siRNA療法可能要優(yōu)于ASOs療法，那會(huì)不會(huì)被未來的一次性治愈的基因編輯技術(shù)所顛覆呢？

★ 基因療法究竟可以讓多少人收益？

目前很多基因療法使用的是AAV病毒載體，但這只能讓一小部分人獲益，比如普通人中對這項(xiàng)試驗(yàn)中使用的AAV5載體具有免疫力的比例可能高達(dá)50%。對于其它類型的AAV，這一數(shù)值可能更高，比如AAV1和AAV2的免疫力可能出現(xiàn)在70%的人群中。那么如何讓這部分人獲益呢，如何開發(fā)出效率更加高的非病毒載體呢？

★ 何時(shí)才能做到對靶組織的精準(zhǔn)遞送？

目前GalNAc系統(tǒng)可以很好的靶向肝臟組織，但前的LNP系統(tǒng)更多的依賴于“自然”靶向過程，如靶向肝細(xì)胞的ApoE依賴的內(nèi)吞途徑、或納米粒子對免疫細(xì)胞的天然靶向，而不是利用配體靶向。肝臟外的其它組織中如何發(fā)揮siRNA、mRNA、及DNA的作用的問題還需要更多的創(chuàng)新技術(shù)。當(dāng)然我們目前也無法在指定組織中達(dá)到足夠數(shù)量的基因修改。

★ 基因療法究竟能治療哪些疾病？

目前基因療法中逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶目的基因的容量通常在 8Kb 左右，而腺相關(guān)病毒僅為 4.5Kb，這種載量對于一些單基因或許還管用。低掛的果實(shí)，何時(shí)會(huì)被開拓者們搶完？未來要面對多基因疾病，甚至是病因不明的疾病，該如何去設(shè)計(jì)？

★ 基因編輯技術(shù)（CRISPR）究竟安不安全？

基因編輯技術(shù)還存在眾多的不確定性：CRISPR技術(shù)是否存在大面積脫靶效應(yīng)？P53介導(dǎo)的修復(fù)增加導(dǎo)致致癌風(fēng)險(xiǎn)？Cas9的免疫風(fēng)險(xiǎn)？這些問題尚未揭開謎團(tuán)。

★ 天價(jià)的基因療法誰來買單？

Glybera的價(jià)格約為100萬美元，自2012年上市后只銷售出1份。由于缺乏市場需求，于2017年黯然退市。Strimvelis的價(jià)格約為70萬美元，2016年5月上市后只銷售出2份，而預(yù)定接受治療的患者也只有2個(gè)。美國強(qiáng)大的商業(yè)醫(yī)保尚且不堪其重，那么中國呢？基因療法治在中國治療罕見病市場究竟會(huì)有幾人能夠買單？

毫無疑問，基因療法領(lǐng)域現(xiàn)在正處于一個(gè)振奮人心的時(shí)代，對生命源代碼的改造是人類歷史上的里程碑。在很多疾病領(lǐng)域，基因療法就是個(gè)奇跡。在這個(gè)基因療法的新時(shí)代，人類似乎第一次可以這么牢牢掌握自己的生命，追逐從根本上治療癌癥和罕見遺傳病的方法。除了高昂的治療費(fèi)用之外，我們?nèi)杂刑嘞嚓P(guān)的技術(shù)需要突破，蜂擁而至的資本會(huì)加速創(chuàng)新的革新，但似乎仍有一段未知的路要走。筆者對基因療法或許有些執(zhí)念，抱有一些不切實(shí)際的幻想，希望未來的治療都可以通過基因療法一次性治愈。（無意看到一篇文章的一段話，抄送給大家）：

一段包裹于載體中的基因

一群改過的細(xì)胞

一次或幾次的注射

足以改變?nèi)祟惤】档拿婷?/p>

甚至可能引發(fā)深刻的社會(huì)變革

然而我們堅(jiān)信

這正是未來藥物和治療的模樣

參考文獻(xiàn)：

[1] Wang D, Tai P W L, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2019: 1.

[2] Setten R L, Rossi J J, Han S. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2019: 1.

[3]華金證券：基因治療：醫(yī)學(xué)革命正在到來（上篇·技術(shù)）

（完）