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Circular RNA (circRNA)自大約1979年被發(fā)現(xiàn)，之后的30年里幾乎無(wú)人問(wèn)津，直到近幾年出現(xiàn)了爆發(fā)性的研究增長(zhǎng)，研究熱點(diǎn)也已從開(kāi)始的大規(guī)模篩選鑒定逐漸轉(zhuǎn)向特定基因的功能和機(jī)制研究。 除了CDR1as(ciRS-7)和circ-FOXO3等少數(shù)幾個(gè)基因有多篇文章報(bào)道其功能和作用機(jī)制外，大量cricRNAs的功能研究還是空白，這其中過(guò)表達(dá)（功能獲得性研究，gain of function）自是避不開(kāi)的重中之重。不同于mRNA，circRNA由于其形成的復(fù)雜性和表達(dá)的多態(tài)性，對(duì)其過(guò)表達(dá)有更大的難度，大部分同學(xué)也都碰到了各種各樣的問(wèn)題。 綜合文章和其他人的反饋來(lái)看，circRNA過(guò)表達(dá)主要三個(gè)難點(diǎn)： 湖人今天就為大家支幾招，介紹具體怎么構(gòu)建circRNA的過(guò)表達(dá)載體，明天還將介紹怎么嚴(yán)謹(jǐn)地驗(yàn)證是否過(guò)表達(dá)成功。 第一招：拿來(lái)主義 “你能想到的，別人早都想到了，而且還發(fā)了文章。”研究生幾年里聽(tīng)到最多的大概就是這句話了，每每興奮有個(gè)奇思妙想，最后總是碰一鼻子灰，畢竟研究既要novel又要有mechanism可一點(diǎn)都不容易，這時(shí)候拿來(lái)主義就顯得比較有用了。我做不好，總有人做的專業(yè)呀！ 目前國(guó)內(nèi)能提供circRNA過(guò)表達(dá)業(yè)務(wù)的公司很多，都有現(xiàn)成的方案和空載體，直接拿來(lái)用就行了。這里我以自己用過(guò)的某公司產(chǎn)品pLCDH-ciR舉例，據(jù)介紹該載體基于模擬內(nèi)源性的環(huán)化模式開(kāi)發(fā)，由兩個(gè)通用的成環(huán)框架介導(dǎo)環(huán)化和剪切，框架序列包括一段反向重復(fù)（Alu）序列和一段效應(yīng)QKI蛋白的序列，以及一段人工修改的剪切介導(dǎo)序列，整體框架可使插入的環(huán)狀RNA序列高效率環(huán)化，并精確地在AG-GT位點(diǎn)嚴(yán)格剪切。應(yīng)該就是和內(nèi)源的側(cè)翼Alu序列介導(dǎo)環(huán)化一個(gè)原理，不過(guò)特殊設(shè)計(jì)了序列，以使對(duì)不同的插入序列都能介導(dǎo)環(huán)化，并且可以準(zhǔn)確剪切，邏輯思路還是很清晰的。
該載體使用需要先擴(kuò)增目的circRNA序列，在5’和3’端加上一段介導(dǎo)序列（聽(tīng)說(shuō)可以調(diào)控準(zhǔn)確剪切）和兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoRI/BamHI，然后做酶切連接。這和其他載體構(gòu)建是一樣的流程，幾天就可以構(gòu)建完成，還是很簡(jiǎn)便的，重點(diǎn)是通用性高，隨便挑個(gè)基因都可以這樣做，很適合同時(shí)做多個(gè)基因，拿來(lái)用之，省時(shí)省力呀！ 第二招：他山之石 讀文獻(xiàn)，讀文獻(xiàn)，讀文獻(xiàn)，重要的事情說(shuō)三遍。這里要介紹的第二招就是看文章來(lái)的，在Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production（Genes Dev. 2014;28:2233–2247）這篇文章里，作者分析了circ-ZKSCAN1的側(cè)翼序列和Alu元件，首先克隆ZKSCAN1的exon2/3和側(cè)翼序列共2232bp來(lái)構(gòu)建載體，成功過(guò)表達(dá)了circ-ZKSCAN1。接著對(duì)側(cè)翼序列具體分析，一段一段地刪除序列再檢測(cè)基因過(guò)表達(dá)情況，以得到真正決定成環(huán)的側(cè)翼序列區(qū)，最終保留5’端側(cè)翼序列87bp，3’端側(cè)翼序列59bp，并將ZKSCAN1的exon2/3替換成一段多克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)空載體pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector。 pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector示意圖：
該載體使用也是以酶切位點(diǎn)連接目的circRNA序列，但可能由于側(cè)翼的成環(huán)序列比較短，介導(dǎo)成環(huán)能力有限。我做過(guò)的幾個(gè)基因過(guò)表達(dá)倍數(shù)普遍不高，還有錯(cuò)誤成環(huán)，把框架序列也加到成環(huán)產(chǎn)物里了的，這樣的恐怕不能往下做。想使用這個(gè)載體的同學(xué)，建議去掉酶切位點(diǎn)，直接把成環(huán)序列加到你circRNA的兩端，這樣應(yīng)該可以保證成環(huán)準(zhǔn)確。 第三招：回本溯源 前面兩招都是使用通用的載體，其成環(huán)序列是模擬和替換內(nèi)源性的模式，這里第三招回本溯源就要介紹使用基因天然的側(cè)翼序列構(gòu)建載體了。很明顯幾乎所有circRNA成環(huán)都和本身的側(cè)翼序列直接相關(guān)，那我們把基因和其本身的側(cè)翼序列一起克隆出來(lái)，放到載體上自然也應(yīng)該可以過(guò)表達(dá)。 對(duì)于側(cè)翼序列的選擇，最理想的情況是上下游1kb內(nèi)都有明顯的重復(fù)元件（Alu），克隆到的側(cè)翼序列含兩個(gè)或以上重復(fù)元件分布在circRNA的上下游，可以促使成環(huán)和剪切，這和體內(nèi)天然的形成模式是一致的。
這里的has_circ_0007874由兩個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)度318bp，我向上下游各延伸1kb，在Repeat Element處可以看到都有明顯的重復(fù)元件，下一步導(dǎo)出序列，只截取上下游各延長(zhǎng)550bp即可，過(guò)長(zhǎng)的序列可能導(dǎo)致克隆難度增加，這里550bp內(nèi)有重復(fù)元件，肯定夠用了。序列里下劃線標(biāo)記的就是延伸的側(cè)翼序列，其中小寫(xiě)代表重復(fù)元件，紅色標(biāo)記的AG-GT是剪切位點(diǎn)。可以PCR法或基因合成克隆這一段1418bp序列到載體上（如pcDNA3.1）就可以過(guò)表達(dá)has_circ_0007874了。
PS：此處僅以has_circ_0007874為例說(shuō)明分析和確定側(cè)翼成環(huán)序列的思路，我自己沒(méi)有實(shí)際做過(guò)這個(gè)基因。 第四招：移花接木 前面講了先模擬再通用，又介紹了基因特異的成環(huán)方案，這里第四招移花接木要介紹將基因特異的成環(huán)方案換成一個(gè)通用的方案。對(duì)于cricRNA過(guò)表達(dá)，總是依賴側(cè)翼序列促使成環(huán)來(lái)得方便，那我們是否可以將has_circ_0007874的側(cè)翼序列拿去過(guò)表達(dá)其他基因呢？答案是肯定的。 具體做法也簡(jiǎn)單粗暴，把第三招里的全長(zhǎng)序列復(fù)制下來(lái)，接著把內(nèi)部AG-GT之間的has_circ_0007874序列換成你要研究的circRNA，也即替換中間的NNNN，然后構(gòu)建載體，就可以成功過(guò)表達(dá)啦。
第五招：無(wú)招勝有招 前面四招我相信基本可以覆蓋所有circRNA了，一招不成功就換另一招。可能還有些同學(xué)飽受deadline的摧殘，趕時(shí)間畢業(yè)或評(píng)職稱，特別一些學(xué)臨床的沒(méi)有條件和資源做實(shí)驗(yàn)，給你們的第五招就是請(qǐng)外援，找公司！畢竟我們講專業(yè)的事交給專業(yè)的人做，你沒(méi)時(shí)間做，沒(méi)實(shí)驗(yàn)條件，或者總是做不成功的，都可以嘗試找公司做。我自己有接觸過(guò)一兩家，還是很靠譜的，需要做的就是提供基因信息，然后等結(jié)果，看似無(wú)招實(shí)則勝過(guò)所有招數(shù)啊。 好了，上面的五種招數(shù)應(yīng)該夠用，湖人也祝所有同學(xué)都可以成功。明天我將繼續(xù)講解怎么嚴(yán)謹(jǐn)地驗(yàn)證是否過(guò)表達(dá)成功，我們江湖再見(jiàn)！ |
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