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自circRNA首次在擬南芥中報(bào)道后，植物circRNA中的研究便拉開序幕。今天要分享的文章是一篇早期植物circRNA鑒定的文章，題目是Widespread noncoding circular RNAs in plants。該篇文章發(fā)表于New Phytologist（影響因子7.33），ISI期刊引文報(bào)告排名：9/211（植物科學(xué)）。 背景： 1. 早在上世紀(jì)，陸續(xù)有報(bào)道顯示真核細(xì)胞中環(huán)狀 RNA 的存在，但在當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是剪切錯(cuò)誤的產(chǎn)物。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析的發(fā)展，Salzman 等人首次指出環(huán)狀 RNA 由 mRNA 前體可變剪切得來，是一類 3’ 與 5’端共價(jià)閉合，廣泛大量存在于真核生物體內(nèi)的內(nèi)源性RNA，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。 2. circRNA形成的模型如圖1所示，在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生head-to-tail
splicing （back splicing），當(dāng)剪切體兩端自身發(fā)生互補(bǔ)配對時(shí)，則轉(zhuǎn)錄出circRNA。 3. 根據(jù)來源，circRNA可以分為三類：外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域circRNA. 4. 在人類的研究中，circRNA環(huán)化過程具有以下特征： a.
相鄰長的內(nèi)含子序列中通常富集ALU重復(fù)片段. b.
側(cè)翼內(nèi)含子具有反向互補(bǔ)的特征. c.
RNA結(jié)合蛋白Quaking參與調(diào)控circRNA的形成。 5. circRNA能夠組織時(shí)空特異性表達(dá)，且能夠通過miRNA sponges實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能。  Fig 1 A model showing linear and back splicing for generating linear mRNA and circRNA, respectively. 材料與方法： 1. 數(shù)據(jù)來源：O.
sativa根部(GenBank accession PRJNA215013; read length 101 bp)；A. thaliana葉片(PRJNA218215; read length 100 bp). 2. 使用 BOWTIE2 (v2.0.5)獲得未比對到參考基因組上的RNA測序序列，提取首尾20-nt再次比對到參考基因組找尋唯一的接頭（anchor）位置，并通過側(cè)翼剪切位點(diǎn)GU/AG來確定circRNA的候選序列。每一個(gè)候選circRNA至少包含兩個(gè)獨(dú)立的反向剪切序列。（圖2）  Fig 2 The pipeline
for computational identification of circRNAs in plants following the method
used in animals (Memczak et al., 2013) 3. circRNA的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：簡單來說，作者通過發(fā)散性引物（divergent
primers）在DNA和cDNA模板上擴(kuò)增信息的不同來驗(yàn)證circRNA的存在。PCR條件詳見文章。值得一提的是，實(shí)驗(yàn)對象是參照下載數(shù)據(jù)的文章所述相同條件和部位。同時(shí)，為了驗(yàn)證下載數(shù)據(jù)的真實(shí)性，作者采用相同條件種植水稻，并取相同部位進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。 4. Blast用于序列保守性分析，GO富集分析用于序列功能注釋，MEME用于側(cè)翼內(nèi)含子中5-60nt 保守基序的鑒定。 5. 表達(dá)分析采用FPKM算法計(jì)算，通過Pearson correlation coefficien判斷circRNA與來源基因的共表達(dá)相關(guān)性。 結(jié)果： 1. 對鑒定的數(shù)據(jù)進(jìn)行描述，包括circRNA的數(shù)量、來源分類，見表1。水稻和擬南芥中有 12037 和 6012 個(gè)環(huán)狀 RNA，其中外顯子circRNA數(shù)量較多。同時(shí)，作者從中隨機(jī)選取 (10/18) 個(gè)高表達(dá)的外顯子circRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證測序結(jié)果。 Table 1 Genome-wide identification of circular RNAs (circRNAs) in plants based on RibominusSeq data  UTR, untranslated
region aOther circRNAs refer to those derived from
two or more genes. 2.比對分析了水稻和擬南芥中鑒定circRNA的同源性，其中直系同源對數(shù)目超過700，其中超過 300 個(gè)直系同源親本基因的環(huán)狀 RNA 均來自于基因組相同位點(diǎn)，如圖3例子所示。  Fig 3 An example showing conservation of exonic
circRNAs. 3. 根據(jù)動(dòng)物circRNA研究基礎(chǔ)，分析植物中circRNA側(cè)翼序列結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)植物外顯子circRNA側(cè)翼內(nèi)含子序列并不富含重復(fù)和反向互補(bǔ)序列。同時(shí)，在水稻和擬南芥的circRNA中，未發(fā)現(xiàn)保守的側(cè)翼內(nèi)含子序列。相較于動(dòng)物，植物circRNA側(cè)翼內(nèi)含子要長于線性基因的。 4. 磷處理下水稻根部circRNA表達(dá)與其來源基因的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)349對具有顯著正相關(guān)，且暫未發(fā)現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)的組合。不同處理下的水稻circRNA的表達(dá)不盡相同，說明其表達(dá)具有一定時(shí)空特異性。其中，27個(gè)外顯子circRNA在響應(yīng)磷脅迫中發(fā)揮功能。 5. 通過對產(chǎn)生circRNA的基因組區(qū)域是否包含miRNA結(jié)合位點(diǎn)來預(yù)測circRNA分子靶miRNA，發(fā)現(xiàn)只有小部分的circRNA分子具有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，其中水稻5.0%，擬南芥6.6%. 小結(jié)： 作者選用植物中最基本的研究對象展開circRNA的研究，涵括單子葉及雙子葉植物，通過對比動(dòng)物研究，初步得到植物circRNA同樣具有特異性時(shí)空組織表達(dá)的特性，其表達(dá)與來源基因相關(guān)，且序列保守。但在circRNA形成模式上，植物與動(dòng)物間的特征并不相同，如側(cè)翼序列的重復(fù)片段、內(nèi)含子長度等方面。結(jié)果顯示，circRNA在植物生長過程中同樣起到重要作用，值得深入研究。 該篇文章把握了當(dāng)下研究熱點(diǎn)，為植物circRNA的鑒定研究提供了一個(gè)研究模板。下一篇我們將繼續(xù)分享NP中發(fā)表的另一篇circRNA研究的文章，學(xué)習(xí)優(yōu)秀文章的研究策略。 |
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