最近老師和同學(xué)經(jīng)常問針對(duì)外顯子測(cè)序的家系遺傳病如何進(jìn)行突變篩選,今天小編就撰稿一篇,希望對(duì)老師和同學(xué)有所幫助,話不多說,直接看下面的干貨。

小編碎語：

DNA測(cè)序中從測(cè)序區(qū)域的大小分為全基因組重測(cè)序，全外顯子測(cè)序，靶向區(qū)域測(cè)序。全外顯子大概占DNA全部堿基對(duì)的1%，即大概30M的堿基，目前大部分測(cè)序的全外數(shù)據(jù)量為10G，測(cè)序深度大概為100X-150x左右，不同的試劑盒導(dǎo)致不同的捕獲效率的不同，不同試劑盒的均一度的不同導(dǎo)致不同區(qū)域?qū)嶋H深度不同，由于全外顯子測(cè)序檢測(cè)數(shù)據(jù)量適中(約10G)，與全基因組相比(約90G)，因?yàn)槿祟惣膊∮?0%在外顯子區(qū)域,全外顯子測(cè)序十分具有性價(jià)比，可以發(fā)現(xiàn)與人類疾病關(guān)系密切的外顯子部分的相關(guān)基因突變。全外顯子的測(cè)序應(yīng)用十分廣泛，整體從技術(shù)上來說，1)可以檢測(cè) SNV 的 germ line 突變;2)也可以在一定程度上檢測(cè)腫瘤的 somatic 突變(深度200X以上);3)可以檢測(cè)外顯子區(qū)域的CNV, 融合等突變;從外顯子測(cè)序技術(shù)延伸出的臨床應(yīng)用來說，可以應(yīng)用于以下的方面：1)確定孟德爾遺傳疾病相關(guān)基因；2)風(fēng)險(xiǎn)易感基因的發(fā)現(xiàn)(與全基因組關(guān)聯(lián)分析類似);3)癌癥相關(guān)研究(高深度情況下);

 全外顯子測(cè)序的高通量分析流程如下：

不同試劑盒導(dǎo)致捕獲效率的不同，不同試劑盒均一度的區(qū)別導(dǎo)致不同區(qū)域?qū)嶋H深度差異,下表為目前市場(chǎng)上主流試劑盒的比較。

通過全外顯子生物信息分析，通過初步將得到一些可能的致病突變;如果知道樣本家系屬于何種致病模式，可以使用不同的篩選模式進(jìn)行篩選。篩選模式有：

1)常染色體隱性遺傳

甲、乙：隱性遺傳表現(xiàn)為雙親都沒病，孩子患病。

患病個(gè)體親代是突變攜帶者但表型正常，子代患病，如果不存在近親結(jié)婚或生殖隔離等因素，往往患者同一致病基因的不同位點(diǎn)存在致病突變，即患者帶有復(fù)合雜合突變（compound heterozygous mutations）。由于這類患者一般不多，可以對(duì)同胞患者及其正常雙親進(jìn)行測(cè)序，分析時(shí)尋找子代復(fù)合雜合變異與雙親雜合變異共有的部分，從而發(fā)現(xiàn)致病位點(diǎn)。有時(shí)，僅對(duì)一對(duì)同胞對(duì)（sibpair）或一位患者進(jìn)行測(cè)序即可發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳病致病基因。對(duì)于近親結(jié)婚或生殖隔離等因素導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病，患者致病基因往往存在純合突變，而患者的雙親往往是突變基因的雜合子。這時(shí)應(yīng)當(dāng)在搜尋在患者中呈純合狀態(tài)而在雙親中呈雜合狀態(tài)的變異。在這種情況下，患者雙親的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，越有利于尋找致病位點(diǎn)。

建議選擇核心家系（如患病子代＋雙親，3~4例cases）；但是對(duì)于非近親結(jié)婚家系，盡量避免選取表型正常的同胞作為control，因?yàn)闊o法判斷個(gè)體是否攜帶致病突變，在后續(xù)分析中容易遺漏重要突變信息。

典型病例如白化病、苯丙酮尿癥、半乳糖血癥等。

2）常染色體顯性遺傳

丙、?。猴@性遺傳表現(xiàn)為雙親患病，孩子正常。

高通量測(cè)序技術(shù)用于顯性遺傳病致病基因搜尋的難度比較大，尤其對(duì)于常染色體顯性遺傳病。常染色體顯性遺傳病，致病基因的變異在雜合狀態(tài)下即可發(fā)病。常染色體雜合的變異往往很多，不容易縮小搜尋范圍。如果有相關(guān)基因的較精細(xì)的位置信息（例如小于2Mb的范圍）可以參考，則測(cè)定少數(shù)（甚至一個(gè)）患者即可確定致病位點(diǎn)。否則，則需要測(cè)定較多的患者。當(dāng)確實(shí)需要對(duì)家系內(nèi)多個(gè)患者進(jìn)行測(cè)序時(shí)，盡可能選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的。也可以對(duì)家系中的患者和正常人進(jìn)行測(cè)序，在數(shù)據(jù)分析時(shí)，在前者發(fā)現(xiàn)的雜合變異中，除去那些在后者中存在的雜合變異，余下的部分則包含致病變異。

測(cè)序建議選擇4個(gè)以上患病個(gè)體（通常稱為case）；或者選取至少2例患病個(gè)體（case）和1 例正常個(gè)體（通常稱為control）， case盡量選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的樣本，control盡量選擇與其中一個(gè)患病個(gè)體親緣關(guān)系較近的樣本。

典型病例:如Waardenburg綜合征等。

3)新生突變分析

新生突變（de novo mutations，DNMs）是指父母的生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生并遺傳給下一代的突變，在多種散發(fā)性疾病，尤其是散發(fā)性神經(jīng)精神疾病中扮演著重要的角色?；诤诵募蚁档娜怙@子測(cè)序（whole-exome sequencing， WES）和全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing， WGS）已經(jīng)成為鑒定DNMs最直接有效的方法。 因?yàn)樾律蛔兡Ｊ绞切掳l(fā)生的突變，即篩選父母中均不存在的突變卻在新生兒中存在的突變，著重對(duì)此突變進(jìn)行相關(guān)的研究。

4)細(xì)胞質(zhì)遺傳(主要是線粒體病)

只要母親是患者，其后代都是患者；父親是患者，母親正常，其后代都正常。這是典型的母系遺傳特征，由此可知該病致病基因最可能位于細(xì)胞質(zhì)的線粒體基因中(下圖)。

高通量測(cè)序技術(shù)用于線粒體遺傳病的致病基因,可以直接篩選患病人種線粒體中的共同致病突變。線粒體基因組與核基因組在遺傳上的重要不同是：在一個(gè)細(xì)胞中，核基因組只有兩個(gè)拷貝，一個(gè)來自父親，一個(gè)來自母親；而線粒體基因組幾乎完全來自母親，并且有上千個(gè)拷貝（通常一個(gè)細(xì)胞有1000-2000個(gè)線粒體，一個(gè)線粒體有2-10個(gè)線粒體DNA拷貝）。這種拷貝數(shù)的不同也導(dǎo)致了在DNA突變檢測(cè)上的策略不同。對(duì)于基因組上某一位置的點(diǎn)突變只可能出現(xiàn)三種情況：均無突變，有一個(gè)拷貝發(fā)生突變，或者兩個(gè)拷貝均發(fā)生突變。而對(duì)于線粒體DNA來說，情況就要復(fù)雜的多，從一個(gè)線粒體DNA發(fā)生突變，到上千個(gè)線粒體DNA均發(fā)生突變，其中的突變頻率可以是0.1%~100%中的任何一個(gè)比例,這點(diǎn)在篩選過程中要尤其注意。

典型病例：如CPEO、KSS、MELAS、MERRF等。

5)伴Y遺傳

患者只有男性，男性患者的后代中，男性均患病，女性均正常，且代代相傳，即父?jìng)髯?、子傳孫。由此可知該病致病基因最可能在Y染色體上(下圖)。

高通量測(cè)序技術(shù)用于伴Y遺傳，可以直接篩選Y染色體上的共同致病突變，相對(duì)來說比較簡單。典型病例如人類外耳道多毛癥、鴨蹼病、箭豬病等。

6)伴X隱性遺傳

伴X隱性遺傳病,具有以下明顯特征:1）具有隔代交叉遺傳現(xiàn)象；2）患者中男多女少；3）女患者的父親及兒子一定為患者，簡記為“女病，父子病”；4）正常男性的母親及女兒一定正常，簡記為“男正，母女正”；5）男患者的母親及女兒至少為攜帶者。

疾病呈X連鎖遺傳方式傳遞的家系也適于高通量測(cè)序分析。這類家系有利于縮小致病基因搜尋范圍，因?yàn)樵S多常染色體上的變異被排除了。譬如，對(duì)于X連鎖隱性遺傳病，可以對(duì)男性患者和及其母親（致病突變攜帶者）進(jìn)行測(cè)序，尋找X染色體上case共有的純合變異,control中的雜合變異。然而，需要注意的是，有時(shí)X連鎖與常染色體隱性遺傳方式不易區(qū)分（當(dāng)后者的家系中只有男性患者時(shí)），在進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析時(shí)需要注意。

典型病例:如人類紅綠色盲癥、血友病、果蠅的白眼遺傳、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、家族性遺傳性視神經(jīng)萎縮、眼白化病等。

7)伴X顯性遺傳

伴X顯性遺傳病,具有以下明顯特征:1)不管男女，只要存在致病基因就會(huì)發(fā)病，但因女子有兩條X染色體，故女子的發(fā)病率高于男子。因?yàn)闆]有一條正常染色體的掩蓋作用，男子發(fā)病時(shí)，往往重于女子。2)病人的雙親中必有一人患同樣的病。3)可以連續(xù)幾代遺傳，但患者的正常子女不會(huì)有致病基因再傳給后代。4)男病人將此病傳給女兒，不傳給兒子，女病人（雜合體）將此病傳給半數(shù)的兒子和女兒(下圖)。尋找X染色體上case共有的雜合或者純合變異,control中的沒有變異的位點(diǎn)。

典型病例:抗維生素D佝僂病等。

8)散發(fā)樣本

要求的樣本數(shù)目比家系樣本要多一些。一般建議至少做30例(對(duì)于有些還需要100例以上)患病個(gè)體樣本以上的平行測(cè)序分析。對(duì)大量患病個(gè)體的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定候選疾病相關(guān)變異，一般選取患者中共有的突變而case中不存在的突變,再用傳統(tǒng)一代測(cè)序測(cè)序在其他的相同疾病患病個(gè)體和正常人群中做進(jìn)一步驗(yàn)證。

如果我們?cè)诩蚁的Ｊ较?或者散發(fā)樣本模式下,仍舊沒有找到相關(guān)的突變,那么我們也可以試試采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的分析方法,看能不能找到與疾病有關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association study，GWAS）是對(duì)多個(gè)個(gè)體在全基因組范圍的遺傳變異（標(biāo)記）多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，獲得基因型，進(jìn)而將基因型與可觀測(cè)的性狀，即表型，進(jìn)行群體水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)量或顯著性 p 值篩選出最有可能影響該性狀的遺傳變異（標(biāo)記），挖掘與性狀變異相關(guān)的基因。

全基因組關(guān)聯(lián)分析可以采用plink軟件進(jìn)行分析，模型采用:顯性模型(Dominant model)，隱形模型（Recessive model）和可加模型(Additive model),對(duì)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)和風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行挖掘。全基因組關(guān)聯(lián)分析在只有少量表型數(shù)據(jù)的情況下,通常需要大量的樣本，需要上千個(gè)樣本,目前的研究有些達(dá)到了幾萬或者幾十萬的級(jí)別(在結(jié)合已知突變數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的情況下)。