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隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，我們對于先天性心臟?。–ongenital Heart Disease, CHD, 先心病，此后簡稱為“先心病”）的遺傳學(xué)認(rèn)知在不斷提高，但仍有很多未解之處，尤其是以散發(fā)形式出現(xiàn)的疾病。大規(guī)模平行測序技術(shù)（Massively Parllel Sequencing, MPS）從疾病診斷和致病機制研究的角度為此領(lǐng)域的發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)。得益于此技術(shù)，散發(fā)樣本中新發(fā)突變的致病性不斷被發(fā)現(xiàn)，心血管和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育之間的相關(guān)性被確立，隨后又發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致散發(fā)/家系樣本中潛在遺傳變異的證據(jù)?？v然目前大部分先心病的致病原因仍不清楚，但近期對于不同類型遺傳變異及其不同病因?qū)W機理的發(fā)現(xiàn)，對我們認(rèn)識家族性/散發(fā)先心病具有里程碑式意義。 繼19世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)先心病的遺傳性以來，很多研究者都致力于揭示其遺傳屬性。包括60年代 James Nora等科學(xué)家進(jìn)行的多因素遺傳研究，具有劃時代意義的Baltimore-Washington 嬰幼兒研究（圖1）。早期的先心病家系研究運用連鎖分析、候選基因研究等方法，為揭示結(jié)構(gòu)性心臟病的遺傳背景起到了重要作用。許多重要基因如NKX2-5,GATA4, TBX5, NOTCH1, 和TBX20等均在此時期被發(fā)現(xiàn)。但先心病家系的罕見性使得大家系連鎖分析常用的孟德爾共分離定律在實際運用中十分受限。 2000年初興起的染色體微陣列分析（Chromosomal Microarray, CMA）技術(shù)為本領(lǐng)域的研究提供了新的工具（圖1）。運用此方法，TAB2基因上一段850KB的缺失首次在12位先心病患者中被發(fā)現(xiàn)。隨后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與內(nèi)臟異位，法洛氏四聯(lián)征，左位心等多種先天性心臟缺陷相關(guān)的基因。雖然CMA有很多重要用途，但在臨床診斷中的應(yīng)用，尤其是在排除21三體綜合征、22q11微缺失綜合征等疾病時仍非常受限。繼Reamon-Buettner與Borlak 和Leipzig 心臟招募研究之后，體細(xì)胞突變一度被認(rèn)為是導(dǎo)致先心病的重要機制，但此后根據(jù)此假設(shè)進(jìn)行的研究卻發(fā)現(xiàn)甚少，提示體細(xì)胞突變在先心病的發(fā)生過程中可能并不起主要作用。后來又有研究表明其它致病機制如突變型轉(zhuǎn)錄因子脫靶參與了模式動物中先心病的發(fā)生。 圖1 先心病遺傳發(fā)現(xiàn)、遺傳學(xué)技術(shù)及所用研究方案發(fā)展時間軸 此后，研究者開始意識到應(yīng)用連鎖分析和CMA的方法發(fā)現(xiàn)的遺傳變異大多具有家族特異性，不能反映大多數(shù)散發(fā)型先心病的情況；從而提出了“常見疾病-常見變異（Common Disease–Common Variant）”的假說，認(rèn)為先心病可由多個具有微量效應(yīng)的常見突變所導(dǎo)致。此理論的提出與我們對復(fù)雜性先心病的認(rèn)知相符，于是開啟了全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）的時代，研究常見單核苷酸多態(tài)性位點（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）與先心病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)位點。但遺憾的是，GWAS的應(yīng)用已有十多年，迄今為止仍無法判斷出具體哪些SNP具有真正的致病作用。在分析中具有顯著相關(guān)性的位點，臨床相關(guān)性卻不高；很多GWAS的發(fā)現(xiàn)也不適用于另一種族，只能解釋少部分人的發(fā)病風(fēng)險?？傊?，GWAS不能確定復(fù)雜性先心病的主要遺傳變異，GWAS所發(fā)現(xiàn)位點的作用被歸結(jié)為“遺傳力丟失（Missing Heritability）”。在遺傳力丟失理論的基礎(chǔ)上，還有人提出了“在常見變異和環(huán)境因素的基礎(chǔ)上，罕見變異能發(fā)揮極大效應(yīng)”的理論。 MPS技術(shù)，也稱為二代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)，的發(fā)展為解釋遺傳力丟失提供了有力工具。MPS既可以是靶向測序（如全外顯子組測序、基因組合測序），又可以是非靶向的全基因組測序。得益于MPS偏向性小的技術(shù)特點，基因組常見/罕見變異，堿基插入/缺失，拷貝數(shù)變異等信息都能被挖掘出來；從另一角度講，分析特定個體的遺傳變異，也便于追蹤患者的家系情況。把大規(guī)模的表型、種族相似的散發(fā)人群研究轉(zhuǎn)移到表型明確的家系研究，更適合臨床應(yīng)用。全外顯子組測序在散發(fā)樣本中應(yīng)用也取得了重要進(jìn)展（表1）。當(dāng)只保留無義突變，剪接突變，移碼突變時顯著提高了基因變異與疾病的相關(guān)度，這些研究也提示了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常與非綜合征型先心病之間存在基因?qū)用嫔系年P(guān)聯(lián)性。值得注意的是，綜合征型先心病病例中,新發(fā)生的蛋白截短突變較多，而非綜合征型先心病病例中，遺傳性的蛋白截短突變更多。當(dāng)然，在實際應(yīng)用中二代測序技術(shù)也遇到了很多瓶頸，變異位點的致病性解讀尤其具有挑戰(zhàn)性。其它MPS技術(shù)，例如靶向基因組合檢測也已被應(yīng)用到先心病中。先心病特異性基因組合檢測在家族性非綜合征型先心病患者中致病基因檢出率可達(dá)31%?；蚪M合檢測的目標(biāo)性和特異性強，與其高覆蓋率，低數(shù)據(jù)存儲需求相應(yīng)的是難以挖掘新致病基因的代價?，F(xiàn)如今，隨著WES和WGS測序成本的降低，這類更全面的測序技術(shù)正在被加速推廣?？偠灾?，這些研究展示了MPS技術(shù)在先心病中的成功應(yīng)用，更多的未解之迷的答案可能不在全外顯子組或全基因組信息中，而在基因組學(xué)之外，例如非編碼的調(diào)控組（Regulome）。在以家系形式發(fā)生的先心病中，尤其是小家系中，很有可能是在1個或多個突變位點的基礎(chǔ)上與其它突變共同作用導(dǎo)致表型顯現(xiàn)的。迄今為止，還沒有用WGS技術(shù)進(jìn)行先心病研究的文章發(fā)表，要想弄清其中的遺傳結(jié)構(gòu)，將需要更為復(fù)雜的分析策略。 表1 在散發(fā)先心病中應(yīng)用MPS研究的發(fā)現(xiàn)總結(jié) 在先心病中應(yīng)用MPS技術(shù)，除受試者本身獲益之外，也為我們理解先心病的遺傳構(gòu)架做出了重要貢獻(xiàn)。首先，不是所有看起來是孟德爾遺傳形式的先心病都是由單基因?qū)е拢灿锌赡苁?個或多個基因所致。其次，在最近的一些研究中，一個新穎的、共同的主題是關(guān)于先心病發(fā)病遺傳變異負(fù)擔(dān)。外顯率低及表型差異大使得孟德爾遺傳與復(fù)雜疾病之間的界限越來越模糊。另外，這些研究發(fā)現(xiàn)新發(fā)變異在散發(fā)先心病產(chǎn)生的作用占10%左右。最后，這些研究提示了心-腦發(fā)育之間的遺傳關(guān)聯(lián)，當(dāng)然并不是所有的先心病都有神經(jīng)發(fā)育缺陷，反之亦然。 Zaidi等人提出了先心病基因負(fù)荷的第一個證據(jù)。在對散發(fā)先心病的研究中，他們發(fā)現(xiàn)了H3L4甲基化過程中涉及到的基因有大量新發(fā)突變。隨后，在心臟特異性表達(dá)基因及全部基因中都發(fā)現(xiàn)了大量的破壞性的新發(fā)變異。這些研究的結(jié)果表明，新發(fā)突變和遺傳性罕見變異組合成為疾病的致病原因。有研究發(fā)現(xiàn)在綜合征型的患者中，與無心臟缺陷表型的患者相比有心臟缺陷表型的患者的額外基因負(fù)荷增多；在家系研究中也發(fā)現(xiàn)了額外基因負(fù)荷的現(xiàn)象，家族性先心病樣本中罕見突變和低頻突變（MAF<> 在合并神經(jīng)發(fā)育障礙（Neurodevelopmental Disabilities，NDD）或先天心外畸形（Extracardiac Congenital Anomaly，ECA）的先心病病例中研究發(fā)現(xiàn)，病例組破壞性新發(fā)變異基因比對照組高3倍，心臟特異性表達(dá)基因比對照組高4.7倍。在其它神經(jīng)性疾病研究中發(fā)現(xiàn)的很多額外負(fù)荷基因在心臟中高表達(dá)，提示這些新發(fā)突變具有多效性，會影響心、腦和其它器官的發(fā)育。因此，額外基因負(fù)荷可能在先天性疾病中普遍存在，其中涉及的復(fù)雜發(fā)育過程及相互作用需要進(jìn)一步研究。 理解先心病的遺傳背景對于患者本人和其家庭規(guī)劃以及臨床管理都具有重要意義。大多數(shù)先心病患兒都能存活至成年，研究重點也就轉(zhuǎn)向了改善患者的術(shù)后結(jié)局，管理及生活質(zhì)量。已有研究關(guān)注到了與高效手術(shù)方案及技術(shù)相關(guān)的問題，但對遠(yuǎn)期結(jié)局的認(rèn)識還很匱乏。與術(shù)后結(jié)局相關(guān)的典型研究包括：氨甲酰-磷酸合成酶I型基因型與術(shù)后肺動脈壓力增加相關(guān)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶插入/缺失多態(tài)性與術(shù)后心動過速事件增加有關(guān)；線粒體醛脫氫酶2基因型，與對缺血和再灌注損傷的耐受力有關(guān)。其它類型的變異如CNV也與重要臨床事件相關(guān)。最近, Kim等人發(fā)現(xiàn)先心病兒童中存在拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV），其手術(shù)后增加死亡或移植的風(fēng)險增加2.55倍； 同一小組的早期研究發(fā)現(xiàn)，外科手術(shù)后的嬰兒若在VEGFA和SOD2基因 SNPs： rs833069 和rs2758331上有純合突變，其死亡或心臟移植的風(fēng)險增加了16倍?？偟膩碚f，這些研究表明，CNVs以及特定的基因型是術(shù)后存活及發(fā)生心臟移植的重要因素。 鑒定特定基因型或等位基因與長期外科療效相關(guān)是一個不斷發(fā)展的研究領(lǐng)域，更不用說在直接與臨床管理相關(guān)方面的研究了?；贛PS識別罕見和常見變異的能力，很可能會發(fā)現(xiàn)基因型和遠(yuǎn)期結(jié)局之間的更多關(guān)聯(lián)，從而可提供個性化治療及選擇最佳治療方案。 綜合從連鎖分析、GWAS及最近的MPS研究成果，我們對先心病的致病因素有了更清楚的認(rèn)識，雖然我們不能為每一位患者找到其致病原因，對了解不同變異類型及其作用有了更深入的了解。 圖二. 先心病遺傳學(xué)圖解: 不同形式的非綜合征先心病患者中已知和未知原因的百分比 目前已有約400個基因被發(fā)現(xiàn)與先心病相關(guān)。一些之前未發(fā)現(xiàn)的罕見變異或心臟外表現(xiàn)如NDD相關(guān)變異也可能與先心病相關(guān)。MPS技術(shù)為之做出了重要貢獻(xiàn)。雖然WGS的應(yīng)用正在起步階段，用此方法極有可能找到先心病在非編碼區(qū)的致病位點，包括調(diào)控元件和miRNA。 而介于遺傳背景于環(huán)境因素之間的表觀修飾因子，如在胚胎發(fā)育時期供氧不足也有可能是先心病致病的重要因素。目前來看，先心病致病機制研究最大的瓶頸在于是否能充分解每個特定個體的各類因素、其產(chǎn)生的影響，以及它們是如何致使特定個體發(fā)病的。 將這些信息轉(zhuǎn)化到臨床工作和病人護理中還需要進(jìn)一步提升和改進(jìn)。對于一個孤立的、散發(fā)的先心病的個體來說，目前的基因檢測檢出率很低，但在未來幾年內(nèi)有望取得重大進(jìn)展。但是，現(xiàn)階段已經(jīng)可以為更多的家族性和綜合征型先心病患者提供遺傳診斷。我們現(xiàn)在也有一個統(tǒng)一的假設(shè)可以解釋很多兒童的NDD合并先心病的情況，也進(jìn)一步說明和確立了遺傳學(xué)在先心病中的作用不僅僅是一項科學(xué)研究工作也是揭示臨床困惑的重要過程。 病人管理方面：隨著遺傳解析能力的提高，在非綜合征型家族性先心病，先心病合并其他先天性心外畸形患者中進(jìn)行分子診斷時，診斷率高，值得一試。明確的遺傳學(xué)診斷結(jié)果對于患者管理和家庭計劃具有重要意義。 轉(zhuǎn)化前景：遺傳學(xué)及分子檢測正在被更多的患者接受，尤其是那些癥狀明確，附帶其它出生缺陷或發(fā)育遲緩的患者。確定復(fù)雜的，散發(fā)形式的潛在遺傳負(fù)荷是下一步的發(fā)展方向。 參考文獻(xiàn)：Blue, G. M., et al. 'Advances in the Genetics of Congenital Heart Disease: A Clinician's Guide.' Journal of the American College of Cardiology 69.7(2017):859. |
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