3.  序列變異解讀的擬定標(biāo)準(zhǔn)

以下評(píng)估變異證據(jù)的方法是用了解釋在臨床診斷實(shí)驗(yàn)室中具有疑似遺傳(主要指孟德爾遺傳)疾病患者的變異. 并不適用于解讀體細(xì)胞變異、藥物基因組(PGx)變異、或者是多基因非孟德爾復(fù)雜疾病相關(guān)的基因變異. 在外顯子組或基因組研究中, 對(duì)候選基 因(意義不明確的基因(GUS))應(yīng)用這些準(zhǔn)則時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎(見下面注意事項(xiàng)), 因?yàn)楸局改夏康牟皇菨M足鑒定新致病基因的研究需求.

雖然這些方法可用于評(píng)估在健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的變異或與測(cè)試指征不相關(guān)的變異,  但是正如在指南的幾個(gè)部分中所述,  對(duì)于與指征無關(guān)的有較低先驗(yàn)致病性的變異時(shí)需更加謹(jǐn)慎. 盡管期望本指南適用于變異分類,  無論其是通過分析單基因、基因包、外顯子組、基因組或者轉(zhuǎn)錄組而鑒定的,  重要的是要關(guān)注與疾病有關(guān)的致病變異和雖然預(yù)測(cè)為對(duì)蛋白有破壞/損傷但卻與疾病無充分關(guān)聯(lián)的變異之間的區(qū)別.這些規(guī)則旨在確定在孟德爾遺傳病中有明確作用的基因的變異是否對(duì)該遺傳疾病是致病的.  針對(duì)具體的病人, 致病性判定應(yīng)該獨(dú)立于對(duì)疾病病因的解讀. 例如, 某變異在一個(gè)案例中被評(píng)估為“致病的”,  而在另一個(gè)案例中,  由于不能解釋該疾病,  就對(duì)這個(gè)位點(diǎn)不給出“致病的”評(píng)價(jià), 這樣的情況是絕對(duì)不允許的. 確定致病性需要將全部的證據(jù)匯集在一起,  包括所有的案例分析,  最終得出一個(gè)結(jié)論.

此指南的分類方法可能比目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格.  這將導(dǎo)致很大一部分的變異被歸類為“意義不明確的”. 希望這種方法可以大量減少那些沒有足夠分類證據(jù)支持而報(bào)告為致病原因的變異 . 需要注意的是, 當(dāng)臨床實(shí)驗(yàn)室報(bào)告一個(gè)變異為“致病 的”時(shí), 醫(yī)療單位很可能把其當(dāng)作“可指導(dǎo)臨床作為 的(actionable)”, 基于這個(gè)判斷, 從而會(huì)改變對(duì)患者的治療、監(jiān)測(cè)，或去除對(duì)基因型為陰性的家庭成員的治療、監(jiān)測(cè)(參見下面的醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)該如何使用 這些指南和建議).

本指南提供了兩套標(biāo)準(zhǔn):  一是用于對(duì)致病或可能致病的變異進(jìn)行分類(表 3),  另一是用于對(duì)良性或可能良性的變異進(jìn)行分類(表 4). 致病變異標(biāo)準(zhǔn)可分為非常強(qiáng)(very  strong,  PVS1),  強(qiáng)(strong, PS1~4);  中等 (moderate,  PM1~6),  或輔助證據(jù) (s upport i ng, PP1~5).  良性變異證據(jù)可分為獨(dú)立(stand-alone,  BA1), 強(qiáng)(strong, BS1~4), 或輔助證據(jù)(BP1~6). 其中, 數(shù)字只是作為有助于參考的分類標(biāo)注, 不具有任何意義. 每個(gè)類別中的數(shù)字不表示分類的任何差異, 僅用來標(biāo)記以幫助指代不同的規(guī)則. 對(duì)于一個(gè)給定的變異, 用戶基于觀察到的證據(jù)來選擇標(biāo)準(zhǔn). 根據(jù)表5的評(píng)分規(guī)則把標(biāo)準(zhǔn)組合起來進(jìn)而從5級(jí)系統(tǒng)中選擇一個(gè)分類. 這些規(guī)則適用于變異上的所有可用數(shù)據(jù), 無論是基于調(diào)查現(xiàn)有案例獲得的數(shù)據(jù), 還是來源于先前公布的數(shù)據(jù). 未發(fā)表的數(shù)據(jù)也可以通過公共數(shù)據(jù)庫(kù)(如 ClinVar 或位點(diǎn)特異數(shù)據(jù)庫(kù))和實(shí)驗(yàn)室自有數(shù)據(jù)庫(kù)獲得. 為了對(duì)變異分類具有較好靈活性, 基于收集的證據(jù)和專業(yè)判斷, 可以把某些依據(jù)用到不同的證據(jù)水平上去.  例如,  如果一個(gè)變異多次和已知致病性變異處于反式位置(位于另一染色體上), PM3 可以上調(diào)到強(qiáng)(進(jìn)一步指導(dǎo)見PM3 BP2順/反式檢測(cè)). 相反, 在數(shù) 據(jù)并不像描述的那么強(qiáng)的情況下, 可以改判變異到一個(gè)較低的水平(見表3注2 PS4). 如果一個(gè)變異不符合分類標(biāo)準(zhǔn)(致病的或良性的), 或良性和致病的證據(jù)是相互矛盾的, 則默認(rèn)該變異為“意義不確定的”. 程度判斷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表6所示. 請(qǐng)注意, 當(dāng)考慮所有 依據(jù)以解讀變異證據(jù)強(qiáng)度的差異時(shí), 需專家介入進(jìn)行判斷.

下面更詳細(xì)的變異分類標(biāo)準(zhǔn)(表3和4)中提及了某些概念的解釋, 并提供實(shí)際使用中的實(shí)例和/或誤區(qū)或易犯錯(cuò)誤的地方. 這部分應(yīng)該與表3及4一同閱讀.

3.1 PVS1極強(qiáng)致病性變異

某些特定類型的變異(如無義突變、移碼突變、經(jīng)典剪接位點(diǎn)±1或2點(diǎn)突變、起始密碼子變異、單個(gè)或多個(gè)外顯子缺失)被認(rèn)為因無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或由無義突變引起的轉(zhuǎn)錄子降解, 導(dǎo)致基因產(chǎn)物完全缺失而破壞基因功能. 當(dāng)將這類變異歸類為致病性時(shí), 從業(yè)人員需謹(jǐn)慎考慮以下原則:

(i) 當(dāng)將該類變異歸類為致病性時(shí), 需確認(rèn)無功能變異(null variants)是已知的致病機(jī)理, 且與該疾病的遺傳模式相一致. 例如, 有些基因(如許多肥厚性心肌病基因)只有雜合錯(cuò)義突變時(shí)才致病, 而雜合無功能變異卻是良性的. 僅基于這一項(xiàng)證據(jù)來看, 對(duì)顯性肥厚性心肌病來說, MYH7基因上出現(xiàn)一個(gè)新的雜合無義突變不一定是致病的, 而 CFTR 基因上出現(xiàn)一個(gè)新的雜合無義突變則有可能是一個(gè)隱性致病變異.

(ii) 當(dāng)文獻(xiàn)中將 3′遠(yuǎn)端下游截短變異注釋成致病突變時(shí), 要特別小心. 特別是當(dāng)所預(yù)測(cè)的終止密碼子出現(xiàn)在最后一個(gè)外顯子, 或者出現(xiàn)在倒數(shù)第二個(gè)外顯子的最后50個(gè)堿基對(duì)時(shí), 這種無義突變介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄降解可能不會(huì)發(fā)生,  這個(gè)蛋白很可能會(huì)表達(dá).據(jù)此所預(yù)測(cè)的截短蛋白的長(zhǎng)度也是致病性評(píng)估的因素,  但這些變異未經(jīng)功能分析是無法進(jìn)行判定的. 

 (iii) 就剪接位點(diǎn)變異而言,  因外顯子剪切位點(diǎn)的供體/受體位點(diǎn)改變或產(chǎn)生了新的剪切位點(diǎn),  從而可能導(dǎo)致外顯子丟失、縮短, 也可能會(huì)使內(nèi)含子序列變成外顯子部分. 雖然剪切位點(diǎn)變異可能被預(yù)測(cè)為無功能變異, 然而該變異類型造成的影響需要通過 RNA 或蛋白質(zhì)功能分析確認(rèn). 還必須考慮可讀框內(nèi)缺失/插入的可能性, 其長(zhǎng)度變化較小(PM4),可以保留蛋白質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域, 因此導(dǎo)致輕微或中性效應(yīng), 或功能獲得效應(yīng).

(iv)  基因會(huì)有不同的轉(zhuǎn)錄本, 哪一種轉(zhuǎn)錄本與生物學(xué)功能相關(guān), 在哪些組織會(huì)表達(dá)哪些轉(zhuǎn)錄本, 這些都是需要進(jìn)行重點(diǎn)考慮的. 如果一個(gè)截短變異只限于一個(gè)或并非所有轉(zhuǎn)錄本, 則必須謹(jǐn)慎考慮到可能存在其他同功型蛋白質(zhì),  防止過度解釋.

(v)  如果發(fā)現(xiàn)一個(gè)無功能變異位于某個(gè)外顯子上,  而該外顯子先前無致病變異報(bào)道,  那么該外顯子可能被選擇性剪切了,  此時(shí)需要謹(jǐn)慎考慮該變異的致病性. 當(dāng)預(yù)測(cè)的截短變異是偶然發(fā)現(xiàn)時(shí)(與檢測(cè)指征無關(guān))則應(yīng)特別小心, 在這種情況下該位點(diǎn)致病的可能性非常低.

3.2  PS1突變?yōu)橥话被?/span>

多數(shù)情況下, 尤其是當(dāng)致病機(jī)制是蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變時(shí), 如已確定某一錯(cuò)義變異是致病變異, 應(yīng)考慮到與其位于同一變異位點(diǎn)的不同形式的堿基改變也可能產(chǎn)生相同的錯(cuò)義突變結(jié)果——氨基酸改變相同(如c.34G>C(p.Val12Leu)和c.34G>T(p.Val12Leu)), 那么, 這些變異也應(yīng)是致病突變. 此外, 還應(yīng)考慮到, 變異可能不是通過改變氨基酸的水平, 而是通過改變DNA的序列來發(fā)揮作用, 例如, 破壞剪接 位點(diǎn)(可通過軟件分析確定), 在這種情況下, 上述的假設(shè)是不成立的.

3.3  PS2 PM6新發(fā)變異

當(dāng)將一個(gè)新發(fā)變異(父母樣本檢測(cè)結(jié)果陰性)歸類為強(qiáng)的致病證據(jù)時(shí), 需要滿足以下條件: (i) 身份檢驗(yàn)表明患者的父母是其生物學(xué)父母. 注意如果父母的身份是假定的而沒有被證實(shí), 則判定為PM6; (ii) 患者的家族史符合新發(fā)變異特征.  例如,  顯性遺傳病患者的父母均未患病. 在存在生殖細(xì)胞嵌合現(xiàn)象時(shí)也可能有1個(gè)以上同胞患病; (iii) 患者的表型與變異基因異常引起的表型相吻合. 例如, 患者具有特殊面容、多毛和上肢缺陷(即 Cornelia de Lange 綜合征), 檢測(cè)到NIPBL基因的新生突變即為強(qiáng)致病證據(jù), 而患者僅表現(xiàn)為非特異性的發(fā)育遲緩, 通過外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的該基因的新發(fā)變異, 則判斷此變異致病性的證據(jù)較弱.

3.4  PS3 BS3功能研究

功能實(shí)驗(yàn)研究是一種研究變異致病性的非常強(qiáng)大的工具, 然而并非所有的功能研究都能有效地預(yù)測(cè)基因或蛋白的功能. 例如, 一些酶學(xué)實(shí)驗(yàn)利用成熟 完善的方法可以用來評(píng)估錯(cuò)義變異在代謝途徑中對(duì)酶活性的影響(如 α-半乳糖苷酶功能實(shí)驗(yàn)); 而另一方 面, 某些功能實(shí)驗(yàn)在評(píng)估變異對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響時(shí)缺乏一致性. 評(píng)估一個(gè)功能檢測(cè)方法是否有效時(shí), 必須考慮該功能實(shí)驗(yàn)在多大程度上反映了其發(fā)揮功能的生物環(huán)境. 例如, 與體外表達(dá)蛋白相比, 直接在患者或動(dòng)物模型的活檢組織中進(jìn)行酶的功能實(shí)驗(yàn)更有說服力. 同樣, 可以反映蛋白質(zhì)全部生物學(xué)功能 (如酶分解底物功能)的實(shí)驗(yàn)則比僅反映一部分功能 (如一種有附帶結(jié)合能力的蛋白水解 ATP 的功能)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)性更強(qiáng). 功能實(shí)驗(yàn)的有效性、重復(fù)性和穩(wěn)定性應(yīng)重點(diǎn)考慮, 這些參數(shù)用來評(píng)估功能實(shí)驗(yàn)的分析 性能以及判定樣本診斷信息的完整性, 該完整性容易受標(biāo)本采集的方法及時(shí)間 、存儲(chǔ)及運(yùn)輸?shù)挠绊?. CLIA(臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案)認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)方法或商品化試劑盒可減少這些因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響. 評(píng)估變異在剪接位點(diǎn)、編碼序列、非翻譯區(qū)以及 更深的內(nèi)含子區(qū)域的影響時(shí), 對(duì)變異在信使RNA水平(如信使 RNA 的穩(wěn)定性、加工或翻譯)進(jìn)行評(píng)估, 可以提供豐富的信息. 相關(guān)的技術(shù)方法包括對(duì) RNA 和/ 或互補(bǔ)DNA 衍生物進(jìn)行直接分析, 以及體外微小基因剪接分析.

3.5  PS4 PM2 BA1 BS1 BS2 變異頻率及對(duì)照人群的使用

通過搜 索公共人群 數(shù)據(jù)庫(kù)(如千人基因組數(shù)據(jù) 庫(kù), NHLBI 外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù), EXAC 數(shù)據(jù)庫(kù); 表 1), 并利用已發(fā)表文獻(xiàn)中相同種族的對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行基因變異頻率分析(譯者注: 此條款在指南更新時(shí)會(huì)有修改), 通過分析變異基因在對(duì)照人群或普通人群中的攜帶頻率, 有助于評(píng)估該變異的潛在致病性. NHLBI 外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)來源于白種人和非裔美國(guó)人群 , 根據(jù)其數(shù)據(jù)覆蓋量能夠識(shí)別是否存在基因變異. 盡管千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏評(píng)估基因變異能力, 但它囊括了更多的種族人群, 因此其數(shù)據(jù)具有更廣泛代表性的. EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)近期發(fā)布了一組來源于不同人群的6萬(wàn)多個(gè)外顯子組的等位基因頻率數(shù)據(jù), 包括了大約三分之二的 NHLBI 外顯子測(cè)序數(shù)據(jù). 一般情況下, 某一等位基因在對(duì)照人群的頻率大于疾病預(yù)期人群(表 7)時(shí), 可認(rèn)為是罕見孟德爾疾病良性變異的 強(qiáng)證據(jù)(BS1), 如果頻率超過 5%時(shí), 則可認(rèn)為是良性變異的獨(dú)立證據(jù)(BA1). 此外, 如果疾病發(fā)生在早期, 且變異在健康成人中以隱性(純合子)、顯性(雜合子) 或X-連鎖(半合子)的狀態(tài)存在, 那么這就是良性變異的強(qiáng)證據(jù)(BS2). 如果數(shù)據(jù)庫(kù)中未能檢出變異的存在, 應(yīng)該確認(rèn)建立該數(shù)據(jù)庫(kù)采用的測(cè)序讀長(zhǎng)深度是否足以檢測(cè)出該位點(diǎn)上的變異.  如果在一個(gè)大樣本的普通人群或隊(duì)列數(shù)據(jù)的對(duì)照人群(>1000 人)中變異不存在(或隱性遺傳的突變頻率是低頻), 并且攜帶此變異的患者與對(duì)照人群為同一種族, 那么可以認(rèn)為該變異是致病性的中等證據(jù)(PM2). 許多良性變異是“個(gè)體化的”(即個(gè)人或家系獨(dú)有的), 因此即使在相同種族的人群中缺乏也不能作為致病性的充足甚至強(qiáng)的證據(jù).

當(dāng)孟德爾遺傳病表型顯著、頻率差異大且是早期發(fā)病時(shí),  使用通過“病例－對(duì)照”人群研究獲得的變異數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行變異分析是最有效的. 臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的患者可能包括“排除”某一疾病的個(gè)體,  因此他們可能不能作為表型顯著的病例; 當(dāng)使用普通人群作為對(duì)照群體時(shí),  具有亞臨床疾病的個(gè)體總是可能存在的. 在這兩種情況下, 認(rèn)為檢測(cè)出的變異致病性證據(jù)不充分.  變異頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異可以假定為致病性的支持證據(jù).  與此相反,  對(duì)于統(tǒng)計(jì)差異不顯著, 特別是極為罕見變異和不明顯的表型, 應(yīng)謹(jǐn)慎 解釋.

比值比(OR)或相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)用于衡量基因型(即存在于基因組中的變異)和表型(即所患疾病/結(jié)果)之間的關(guān)聯(lián),  適用于任何孟德爾疾病或復(fù)雜疾病.  本指南只涉及其在孟德爾疾病中的使用.  相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)與OR不同,  但概率較小時(shí)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)近似等于OR.  OR值為1.0 意味著該變異與疾病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān), 大于 1.0 意味著變異與疾病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān), 小于 1.0 意味著變異與疾病風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān).  一般情況下,  具有孟德爾中等效應(yīng)的變異, 其OR 值為 3 或者更大, 高度外顯的變異具有非常高的 OR 值,  例如,  APOE 基因 E4/E4 純合子與E3/E3 純合子相比, OR值為 13(https://www./ home/education-outreach/past-summer-interns/2012-summer-interns/Erika-kollitz.aspx#.VOSi3C7G_vY)。OR值的置信區(qū)間(confidence interval, CI)也是一個(gè)重要的衡量工具. 如果 CI 中包括1.0(如 OR=2.5, CI= 0.9~7.4), 則關(guān)聯(lián)的可信度很小. 在上面APOE的例子中,CI為10~16. 在線可獲得簡(jiǎn)單的OR值計(jì)算器(http://www./ConfidOR.htm/;http://easyca-lculateon.com/statistics/odds-ratio.php/).

本文整理自《中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué)》雜志，侵刪