遺傳密碼子擴展技術是研究和操縱蛋白質(zhì)功能的強有力的工具。該技術能夠?qū)⒕哂幸环N或者多種功能（如帶有翻譯后修飾的，正交反應基團的，光交聯(lián)基團的，光保護基團）非天然氨基酸定點插入到感興趣的蛋白中。經(jīng)過科學家20多年的努力，現(xiàn)在已經(jīng)實現(xiàn)了對200多種非天然氨基酸的定點插入。但是，很多工程化的氨酰tRNA合成酶都有一個共同的缺陷：底物選擇性差，也就是可以識別多種非天然氨基酸。比如p-氰基-L-苯丙氨酰tRNA合成酶(pCNFRS)至少可以識別18種非天然氨基酸，包括p-氰基-L-苯丙氨酸，p-疊氮基-L-苯丙氨酸以及其它苯環(huán)對位取代的苯丙氨酸衍生物。因此，當培養(yǎng)基中同時含有多種非天然氨基酸，尤其是從同一個天然氨基酸衍生得到的非天然氨基酸時，很難實現(xiàn)對某一種非天然氨基酸的定點插入。

在本文中，作者采用直接進化的策略(如圖1)顯著提高了氨酰tRNA合成酶對特定非天然氨基酸的選擇性。該策略首先通過易錯PCR建立一個包含多種TAG突變的氨酰tRNA合成酶庫，然后在多種非天然氨基酸同時存在下，進行兩輪正向的篩選。第一輪篩選是利用包含TAG的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶及同源的tRNA_CUA找到具有活性的氨酰tRNA合成酶。第二輪篩選則是用帶有TAG的報告蛋白及同源的tRNA，結(jié)合特定氨基酸的性質(zhì)，通過流式細胞儀找到能識別該氨基酸的氨酰tRNA合成酶。然后將分選出來的細菌涂布到LB固體培養(yǎng)基上，通過GFP的讀通實驗來驗證篩選出來的合成酶對特定底物的選擇性。以前傳統(tǒng)的篩選方法是基于讀通含有TAG的報告基因進行的篩選，這篇文章發(fā)展的策略是利用流式細胞儀對底物選擇性的讀出進行的篩選，所以得到的氨酰tRNA合成酶可以區(qū)別結(jié)構(gòu)相似的非天然氨基酸。

      圖1. 兩輪正向進化策略的示意圖

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 作者的第一個案例是，利用該策略提高了p-氰基-L-苯丙氨酰tRNA合成酶 (pCNFRS) 對底物的選擇性（見圖2）。首先，他們用易錯PCR構(gòu)建了4.6*10e7容量的tRNA合成酶突變庫，通過第一輪的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選找到能同時識別p-疊氮基-L-苯丙氨酸(pAzF)和p-氰基-L-苯丙氨酸(pCNF)的pCNFRS突變體。然后將該突變庫轉(zhuǎn)入表達sfGFP-2TAG和同源 tRNACUA的E. coli中，讓細菌在含有pAzF和pCNF中培養(yǎng)基生長，隨后加入DBCO-Cy5來檢測pAzF在sfGFP中的插入。通過流式細胞儀可以分選出兩類細胞：Cy5+/GFP+的細胞（該類細胞中含有主要識別pAzF的pCNFRS突變體），Cy5-/GFP+的細胞（該類細胞中含有主要識別pCNF的pCNFRS突變體）。然后將分選的細菌種在只含有pAzF或者pCNF固體培養(yǎng)基中，通過sfGFP的讀通來評估突變體對底物的選擇性。最后作者找的突變體pAzFRS-1可以高選擇性的插入pAzF。與pCNFRS相比，pAzFRS-1對pCNF的插入降到2倍以下。

圖2. 對pAzF選擇性識別的氨酰tRNA合成酶的進化

      另外的一個案例是，作者用該策略提升Nε-乙?；?賴氨酰tRNA合成酶 (AcKRS)的底物選擇性(見圖3)。AcKRS除了可以識別Nε-乙?；?賴氨酸（AcK），還可以識別m-碘-L-苯丙氨酸 (mIF)，m-溴-L-苯丙氨酸 (mBrF)，m-三氟甲基-L-苯丙氨酸 (mCF3F)，m-甲氧基-L-苯丙氨酸 (mMeOF)。同樣地，通過第一輪的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選找到能同時識別AcK和mIF的AcKRS的突變體。然后將該突變庫轉(zhuǎn)入表達Lpp-OmpA-H3-9TAG-His6和同源 tRNA_CUA的E. coli中，讓細菌在含有AcK和mIF中培養(yǎng)基生長，隨后加入anti-His6 (FITC) 和 anti-acetyl H3K9 (PE) 抗體。通過流式細胞儀可以分選出兩類細胞胞：FITC+/PE+的細胞（該類細胞中含有主要識別AcK的AcKRS突變體），F(xiàn)ITC-/PE+的細胞（該類細胞中含有主要識別mIF的AcKRS突變體）。然后將分選的細菌種在只含有AcK和mIF固體培養(yǎng)基中，通過sfGFP的讀通來評估突變體對底物的選擇性。最后作者找到的突變體mIFRS-1可以高選擇性的插入mIF。與AcKRS相比，mIFRS-1對AcK的插入降到7倍以下。

圖3. 對mIF選擇性識別的氨酰tRNA合成酶的進化

      這兩個應用表明本文中發(fā)展的策略可以作為一個通用的方法將多特異性的tRNA合成酶進化成高選擇性的tRNA合成酶。該課題組未來的目標是利用PTM特異性的抗體進化出高選擇性識別PTM的tRNA合成酶，以及利用和反式環(huán)辛烯反應的四嗪探針進化出識別環(huán)辛烯類非天然氨基酸的tRNA合成酶。這個策略為發(fā)展下一代對特定ncAA有高選擇性的合成酶提供了思路。