2.  總論

2.1  術(shù)語(yǔ)

突變是指核苷酸序列的永久性改變, 而多態(tài)性是指頻率超過(guò)1%的變異。雖然術(shù)語(yǔ)“突變”和“多態(tài)性”已被廣泛使用, 但由于這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)已經(jīng)錯(cuò)誤地與致病性和良性結(jié)果關(guān)聯(lián)了起來(lái), 所以往往會(huì)造成混淆。因此, 建議使用“變異”加以下修飾詞替代上述兩 個(gè)術(shù)語(yǔ): 致病性的、可能致病性的、意義不明確的、可能良性的或良性的。雖然這些修飾詞不可能適用所有的人類表型, 但是正如本指南提出的它包含了孟德?tīng)柤膊∠嚓P(guān)的變異分類五級(jí)系統(tǒng)。建議所有致病性(包括可能致病)的結(jié)論需要注明疾病及相應(yīng)的 遺傳模式(如c.1521_1523delCTT(p.Phe508del), 致病性,  囊性纖維化, 常染色體隱性遺傳)。

應(yīng)當(dāng)注意的是, 一些實(shí)驗(yàn)室可能選擇其他等級(jí) (如意義不明確的變異的子分類 , 特別是內(nèi)部使用時(shí)), 這種做法不被認(rèn)為與指南不一致. 還應(yīng)當(dāng)指出的是, 某種程度上本指南推薦的術(shù)語(yǔ)與細(xì)胞遺傳學(xué)基因芯片檢測(cè)的拷貝數(shù)變異分類不同。雖然拷貝數(shù)變異分類系統(tǒng)也包括五級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn), 但是它使用“臨床意義不明確-可能致病的”和“臨床意義不明確-可能良性的”。由于本指南提出的“可能的”變異分類標(biāo)準(zhǔn)比拷貝數(shù)變異分類指南中用到的“可能的”包含更強(qiáng)的證據(jù), 合并這兩個(gè)“可能的”分類會(huì)使醫(yī)務(wù)工作者和臨床報(bào)告接收者產(chǎn)生混淆, 因此大多數(shù)工作組成員不支持使用“意義不明確的”來(lái)修飾“可能致病的” 或“可能良性的”. 然而, 有人認(rèn)為“可能的”一詞的使 用應(yīng)限于有數(shù)據(jù)支持其致病性或良性可能性很大的變異。雖然對(duì)“可能的”一詞沒(méi)有量化的定義, 但是在某些變異分類系統(tǒng)中已有指導(dǎo)性意見(jiàn)。然而, ACMG 開(kāi)放論壇的一項(xiàng)調(diào)查建議“可能的”這一術(shù)語(yǔ)具有更廣泛的適用性。認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn), 建議術(shù)語(yǔ)“可能致病的”和“可能良性的”用來(lái)說(shuō)明一個(gè)具有大于 90%可能引起致病或者可能良性的變異, 盡管是人為的界定, 但還是給實(shí)驗(yàn)室提供了一種共同的定義。類似地, 國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)指南支持致病性的確定水平為 95%, 但是工作組(通過(guò) ACMG 公開(kāi)論壇期間的反饋確認(rèn))認(rèn)為,  臨床醫(yī)生和患者愿意容忍略高的錯(cuò)誤機(jī)會(huì),  從而做出確定為 90%的決定。還應(yīng)當(dāng)指出的是, 考慮到多數(shù)疾病具有異質(zhì)性, 目前大多數(shù)變異沒(méi)有數(shù)據(jù)能將它們量化性地歸于上述五個(gè)變異類別之一。希望隨著時(shí)間的推移, 能夠建立實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)方法來(lái)客觀地賦予變異的致病可信度, 并且采用更嚴(yán)格的方法來(lái)定義臨床專業(yè)人員所期望達(dá)到的可信度, 從而能更完整地詮釋這些術(shù)語(yǔ)及可能性。

新術(shù)語(yǔ)的使用可能需要專業(yè)培訓(xùn), 鼓勵(lì)專業(yè)團(tuán)隊(duì)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)務(wù)工作者進(jìn)行這些術(shù)語(yǔ)的培訓(xùn),也鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室直接對(duì)其開(kāi)具檢測(cè)報(bào)告單的醫(yī)生進(jìn)行培訓(xùn)教育。

2.2  命名

建議通過(guò)一套規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)變異進(jìn)行統(tǒng)一命名來(lái)確保變異的明確定義, 并實(shí)現(xiàn)基因組信息的有效共享和下游使用. 標(biāo)準(zhǔn)的基因變異命名由人類基因組變異協(xié)會(huì) (the Human Genome Variation Society, HGVS) 維護(hù)和版本化 (https://www./mutnom en), 除非另有說(shuō)明, 一般推薦該命名法作為確定變異命名的首要準(zhǔn)則。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該注意他們?cè)趯?shí)驗(yàn)方法中所使用的版本。當(dāng)描述變異時(shí)，可利用這些工具提供正確的 HGVS 命名(http://)。臨床報(bào)告應(yīng)該包含參考序列以確保該變異在 DNA 水平上的明確命名, 并提供編碼和蛋白質(zhì)命名法來(lái)協(xié)助功能注釋(如“g”為基因組序列, “c”為編碼 DNA 序列, “p” 為蛋白質(zhì), “m”為線粒體)。

編碼命名應(yīng)該使用翻譯起始密碼子 ATG 中的 “A”作為位置編號(hào)1來(lái)描述. 在傳統(tǒng)命名已被使用的地方, 當(dāng)今命名應(yīng)該對(duì)傳統(tǒng)命名進(jìn)行額外注釋。參考序列應(yīng)該是完整的, 并來(lái)源于具有版本號(hào)的美國(guó)生物技術(shù)信息參考序列數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi. nlm./Refseq/)或LRG 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lrg-se quence.org)?；蚪M坐標(biāo)應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)基因組版本(如 hg19)或覆蓋整個(gè)基因(包括 5'和 3'非翻譯區(qū)以及啟動(dòng)子)的基因組參考序列來(lái)界定。當(dāng)描述編碼變異時(shí), 應(yīng)該在報(bào)告中使用和提供每個(gè)基因的一個(gè)參考轉(zhuǎn)錄本。該轉(zhuǎn)錄本應(yīng)該是最長(zhǎng)的已知轉(zhuǎn)錄本或者是最具臨床相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄本。協(xié)會(huì)支持的參考轉(zhuǎn)錄本通?？梢酝ㄟ^(guò) LRG 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.)、 CDS 共識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm./CCDS/ CcdsBrowse.cgi) 、人類 基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// www.hgmd.cf.ac.uk) 、 ClinVar(http://www.ncbi.nlm./clinvar)或特異基因座數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定。然而 , 當(dāng)這些區(qū)域發(fā)生臨床可解釋的已知變異時(shí), 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該評(píng)估該變異對(duì)所有臨床相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的影響 , 包括含有其他外顯子或非翻譯區(qū)延伸的可變剪切轉(zhuǎn)錄本。

HGVS(https://www./mutnomen) 并未覆蓋所有類型的變異(如復(fù)雜變異), 但是復(fù)雜變異的可能描述已被報(bào)道。 此外, ACMG 支持 HGVS 命名規(guī)則之外的三種特殊例外: (i) 除了當(dāng)今 HGVS 推薦的“*”和“Ter”, “X”仍然被認(rèn)為用于報(bào)告無(wú)義變異; (ii) 建議根據(jù)指定變異選擇的參考轉(zhuǎn)錄本對(duì)外顯子進(jìn)行編號(hào); (iii) 通常因?yàn)榕R床解釋直接評(píng)估致病性, 所以推薦使用術(shù)語(yǔ)“致病性”而不是“影響功能”。

2.3  文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)使用

目前人類基因組中大量變異不斷被發(fā)現(xiàn), 且已被許多數(shù)據(jù)庫(kù)廣泛收錄。當(dāng)臨床實(shí)驗(yàn)室需要對(duì)某一變異進(jìn)行分類并出具報(bào)告時(shí), 可在已有的數(shù)據(jù)庫(kù)及發(fā)表的文獻(xiàn)中尋找到有價(jià)值的參考信息。如上文提及, 序列數(shù)據(jù)庫(kù)還可用于確定合適的參考序列。數(shù)據(jù)庫(kù)有助于信息收集,  但需謹(jǐn)慎使用。

人群數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)適用于獲取某變異在大規(guī)模人群中發(fā)生頻率的相關(guān)信息。 需要注意的是, 人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息不僅來(lái)源于健康個(gè)體, 也包含致病性的變異。另外, 人群數(shù)據(jù)庫(kù)并不包含變異的功能效應(yīng)及可能關(guān)聯(lián)的表型等相關(guān)信息。在使用人群數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí), 須明確數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的是健康群體的信息還是患病群體的信息; (如能確認(rèn))數(shù)據(jù)庫(kù)是否收錄了同一家庭多名成員的信息以及數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的受試者的年齡范圍。

疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)主要包含病患中發(fā)現(xiàn)的變異以及對(duì)其致病性的評(píng)估。疾病數(shù)據(jù)庫(kù)和特定基因的數(shù)據(jù)庫(kù)常包含一些分類錯(cuò)誤的變異,  這些變異在已發(fā)表的同行評(píng)審的文獻(xiàn)中被錯(cuò)誤判定, 而多數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)在收錄變異相關(guān)信息時(shí)并未對(duì)證據(jù)進(jìn)行基本的審核。因此, 在使用疾病數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí), 考慮患者是如何被確診的尤為重要,  如下所述:

當(dāng)使用數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí),  臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做到:  (i)  確定數(shù)據(jù)庫(kù)的更新頻率, 確定數(shù)據(jù)庫(kù)收錄相關(guān)數(shù)據(jù)時(shí)是否進(jìn)行了?？?  以及采用什么方法進(jìn)行數(shù)據(jù)?？? (ii)確認(rèn)采用 HGVS 命名體系, 并確定描述變異的基因組版本和轉(zhuǎn)錄本參考序列; (iii)  確定數(shù)據(jù)分析準(zhǔn)確度的驗(yàn)證程度(如變異是源自于低覆蓋的新一代測(cè)序, 還是通過(guò)了Sanger 測(cè)序驗(yàn)證), 并分析用于評(píng)估數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度的各種指標(biāo), 要獲得這些信息可能需要閱讀相關(guān)的文獻(xiàn); (iv)  確定收錄對(duì)象的來(lái)源及其唯一性。

變異解讀也需要檢索科學(xué)和醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)。在參考一些采用舊的命名和分類系統(tǒng)或基于單一觀察結(jié)果的文獻(xiàn)時(shí)需要慎重。在參考攜帶某一變異并伴有相關(guān)表型的個(gè)體和家系的信息時(shí), 考慮患者是如何被確診尤為重要。在評(píng)估這些文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)時(shí)需要謹(jǐn)慎客觀, 這是由于受累患者及相關(guān)個(gè)體在基于不同背景和規(guī)模的研究中常常被多次重復(fù)報(bào)道。重復(fù)報(bào)道的發(fā)生可能是由于作者重疊、實(shí)驗(yàn)室間合作或先證者及其家庭成員同時(shí)被不同臨床系統(tǒng)隨訪。而這些重復(fù)報(bào)道可能會(huì)導(dǎo)致受累個(gè)體被錯(cuò)誤地重復(fù)計(jì)數(shù),  進(jìn)而使變異頻率假性增高。作者或其研究機(jī)構(gòu)互相重疊是發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集重復(fù)的第一線索。

臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立一個(gè)內(nèi)部系統(tǒng)對(duì)已報(bào)告的基因序列變異及臨床診斷進(jìn)行記錄。這對(duì)于分析基因型-表型之間的相關(guān)性, 以及該變異在患者和正常人群中的發(fā)生頻率尤為重要。臨床實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)該積極提交變異數(shù)據(jù)到相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù), 如 ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù), 包含提交臨床評(píng)估信息以及用于變異分類的證據(jù), 以幫助人們不斷加深對(duì)人類遺傳變異所產(chǎn)生的效應(yīng)的理解。在任何時(shí)候, 提供臨床數(shù)據(jù)應(yīng)遵循“健康保險(xiǎn)攜帶和責(zé)任法案 (HIPAA)”對(duì)個(gè)人隱私保護(hù)的規(guī)定。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與臨床醫(yī)生合作, 以獲得臨床信息, 從而更好地理解基因型是如何影響臨床表型的, 并解決不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)遺傳變異解讀存在差異的問(wèn)題。臨床變異數(shù)據(jù)庫(kù)極大地促進(jìn)臨床實(shí)驗(yàn)室工作的開(kāi)展 , 因此需對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)展并標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化便于臨床實(shí)驗(yàn)室獲取數(shù)據(jù)庫(kù)的最新信息, 同時(shí)有助于提交更新的信息。例如, ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)允許變異連同臨床表型和診斷相關(guān)信息一并提交, 同時(shí)追蹤提交變異的審核狀態(tài), 以便對(duì)?？辟|(zhì)量的水平提供一個(gè)更加透明的概貌。

2.4 生物信息學(xué)計(jì)算預(yù)測(cè)程序

各種公共和商業(yè)化計(jì)算機(jī)工具可以輔助解讀序列變異。每種工具使用的算法可能有差異, 但都會(huì)包含序列變異在核苷酸及氨基酸水平上作用影響的判斷, 包括變異對(duì)主要轉(zhuǎn)錄本, 可變轉(zhuǎn)錄本, 其他基因組元件影響作用的確認(rèn), 也包括對(duì)蛋白質(zhì)潛在影響作用的判定。這些工具主要分為兩類: 一類可以預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異是否會(huì)破壞蛋白質(zhì)的功能或結(jié)構(gòu); 另一種可以預(yù)測(cè)是否影響剪接(表2)。新的工具已可以處理額外的非編碼序列。

錯(cuò)義改變的影響作用是由不同的條件決定的 , 例如一個(gè)氨基酸或核苷酸的進(jìn)化保守性、其在蛋白質(zhì)序列中的位置及其上下游序列, 以及氨基酸置換導(dǎo)致的生化結(jié)果等。對(duì)各種計(jì)算機(jī)算法中的一個(gè)或幾個(gè)條件進(jìn)行評(píng)測(cè)可以進(jìn)一步評(píng)估錯(cuò)義改變帶來(lái)的影 響。已經(jīng)有一些工作在評(píng)估預(yù)測(cè)軟件的預(yù)測(cè)性能,  是通過(guò)對(duì)這些預(yù)測(cè)軟件之間的相互比較評(píng)估他們預(yù)測(cè)已知致病突變的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一般情況下 ,多數(shù)算法預(yù)測(cè)已知致病的錯(cuò)義突變的準(zhǔn)確率能達(dá)到65%~80%。但是大多數(shù)工具的特異性較低, 導(dǎo)致有些錯(cuò)義改變被過(guò)度預(yù)測(cè)為有害突變, 而且對(duì)于影響較小的錯(cuò)義變異的預(yù)測(cè)也不可靠。目前臨床實(shí)驗(yàn)室常用的錯(cuò)義變異解讀工具有PolyPhen 2， SIFT和 MutationTaster。用于預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異的生物信息分析工具見(jiàn)表。

目前已開(kāi)發(fā)出許多用于預(yù)測(cè)剪接的軟件, 這是基于內(nèi)含子或外顯子水平上剪接位點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生原理基礎(chǔ)上而完成的。一般情況下,  相對(duì)于特異性(60%~80%), 預(yù)測(cè)工具在預(yù)測(cè)剪接位點(diǎn)異常方面具有較高的敏感性(~90%~100%)。一些常用的剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析計(jì)算工具見(jiàn)表2。

雖然許多不同的分析軟件程序使用不同的算法進(jìn)行預(yù)測(cè),  但其基本原理是相似的;  因此,  在序列解讀中, 不同軟件工具組合的預(yù)測(cè)結(jié)果被視為單一證據(jù)而不是相互獨(dú)立的證據(jù)。因?yàn)槊總€(gè)軟件工具基于他們使用的算法都各有優(yōu)缺點(diǎn), 所以仍然建議使用多種軟件進(jìn)行序列變異解讀;  很多情況下,  預(yù)測(cè)性可能因?yàn)榛蚝偷鞍踪|(zhì)序列的不同而有差異。無(wú)論如何,  這些軟件分析結(jié)果只是預(yù)測(cè),  他們?cè)谛蛄凶儺惤庾x中的應(yīng)用應(yīng)該慎重, 不建議僅使用這些預(yù)測(cè)結(jié)果 作為唯一證據(jù)來(lái)源進(jìn)行臨床判斷。