大家好，今天給大家?guī)淼氖?span lang='EN-US'>2017年發(fā)表在nature communication上的文章，題目為“A long-rangecis-regulatory element for class I odorant receptor genes”。本文的通訊作者Junji Hirota是日本東京理工大學(xué)生物工程院副教授，他們實驗室主要研究分子神經(jīng)科學(xué)與遺傳學(xué)、基因調(diào)控和染色體工程，主要研究興趣嗅覺，包括：1、“一個神經(jīng)元一種OR基因”表達(dá)的分子機制；2、嗅覺神經(jīng)元選擇1類或2類受體雙向選擇命運的分子機制；此外還有Trpm5在各種器官中化學(xué)感覺細(xì)胞以及枯草芽孢桿菌基因組載體系統(tǒng)。

1、I類OR基因簇

嗅覺感覺神經(jīng)元OSN只表達(dá)一種氣味受體OR，它要么是坐落于同一染色體同一基因簇附近的I類OR，要么是遍布多個染色體多個基因簇的II類OR。I類OR可以分為α、β兩類，小鼠中β-group的I類OR包括Olfr543，Olfr544和Olfr545。

2、I類OR基因Olfr544的順式調(diào)控元件

    β-I類OR在脊椎動物進(jìn)化中非常保守，為此作者想探究這類基因附近是否存在順式調(diào)控元件。在之前的研究中，作者證明存在Olfr544的順式調(diào)控元件，保守性分析在α和βI類OR之間的區(qū)域在胎盤類哺乳動物中存在同源序列。

    接下來探究Olfr544順式調(diào)控元件的位置，作者做了4種Olfr544基因5’端不同長度的轉(zhuǎn)基因小鼠，并在olfr544后面連接IRES-tauEGFP報告基因。這四種品系的小鼠前三種在OB里可以觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)的嗅小球，但是最后一種Tg-U16無EGFP表達(dá)。說明在Olfr544轉(zhuǎn)錄起始位點前16kb到29kb的13kb的基因間區(qū)域存在調(diào)控Olfr544表達(dá)的順式調(diào)控元件（增強子）。

3、鑒定可能的增強子元件

上面已經(jīng)證實13kb區(qū)域中可能存在增強子元件。因為關(guān)鍵的基因間區(qū)域（比如說轉(zhuǎn)錄增強子）在進(jìn)化過程中常常保守，作者首先在人類基因組上搜尋與小鼠同源區(qū)域，這13kb區(qū)域的VISTA圖顯示了幾個同源峰。接下來作者在其他哺乳動物中驗證了這些同源峰，選擇的胎盤類哺乳動物包括：人類（靈長類）、豚鼠（嚙齒類）、兔子（兔形目）、馬（奇蹄目）、狗（食肉類）、牛（偶蹄目）、非洲象（長鼻目）。圖2b顯示了這些種屬中α和β的I類OR及中間連接區(qū)域的基因組圖譜，分析顯示13kb區(qū)域中間部分包含同源峰的1.9kb的區(qū)域在所有測試的胎盤哺乳動物中都保守。作者將這個區(qū)域定義為“J元件”，并證明J元件作為I類OR基因的增強子在胎盤類哺乳動物進(jìn)化過程中保守。

4、J元件的功能分析

       為了檢驗J元件的功能，作者構(gòu)建了J13k-gVenus Tg和J- gvenus Tg兩種轉(zhuǎn)基因小鼠，兩種轉(zhuǎn)基因均包含了J元件、Olfr544的啟動子區(qū)域、gapVenus報告基因。它們均在位于I類OSN的MOE和OB中表達(dá)gapVenus，表明J元件具有I類OSN特異性增強子活性。

       雙色原位雜交實驗也證實了gapVenus與α、β的I類OR共表達(dá)，但幾乎不與II類OR共表達(dá)，說明J元件有I類OSN的特異性增強子活性。

5、J元件發(fā)揮I類OR基因增強子的功能

       接下來在J元件敲除小鼠△J中利用外顯子芯片分析中發(fā)現(xiàn)129個完整的I類OR中75個基因的mRNA水平顯著性下降，只有1個α的I類OR，Olfr653的水平上升。離J元件2.9Mb的基因Olfr692也顯著性下降，說明J元件在包含I類OR簇里約3Mb的基因組里發(fā)揮調(diào)控作用。而II類OR均沒有顯著性差異，說明J元件是I類OR特異性的。

6、J元件調(diào)控OR基因選擇幾率

       為了鑒別J元件調(diào)控的是OR基因選擇的幾率還是每個OSN中OR表達(dá)水平，作者利用原位雜交檢測表達(dá)OR基因的OSNs并計數(shù)，與芯片結(jié)果成正相關(guān)，即表達(dá)OR基因的OSNs的數(shù)量和mRNA水平相關(guān)，說明J元件調(diào)控OR基因選擇的幾率。

7、J元件起順式調(diào)控作用

    通過將Olfr545-IRES-tauGFP純合小鼠與ΔJ雜合小鼠交配產(chǎn)生兩種不同的雜合后代，其中GFP標(biāo)記的Olfr545等位基因前均包含J元件，而無GFP標(biāo)記的Olfr545等位基因前可能包括完整的J元件（J/J小鼠）或者無J元件（J/ΔJ小鼠）。在J/J小鼠中GFP與Olfr545的共表達(dá)率為50%左右，而在J/ΔJ小鼠近100%，說明J元件起順式調(diào)控作用。

8、等位排斥取決于J元件的活性

       每個OSN以相互排斥的方式表達(dá)一個OR的一個等位基因。如果等位基因排斥在基因水平上是隨機的，理論上一個特定OR基因每個等位基因表達(dá)應(yīng)該占50%。事實上，△H和△P雜合突變小鼠，相關(guān)OR的表達(dá)下降了約50%。但是在Olfr545-IRES-tauGFP雜合小鼠中，J/ΔJ小鼠的GFP表達(dá)量是J/J小鼠約2倍，即兩小鼠總體Olfr545相近。再對J/ΔJ小鼠和J/J小鼠其他OR的表達(dá)做原位雜交實驗也沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，說明完整J元件的I類OR等位基因的表達(dá)頻率增加來補足ΔJ上等位基因的缺失或下降。換句話說，I類基因的等位排斥不僅是通過隨機選擇一個I類等位基因建立的，而且取決于J元素的活性。

9、J元件中的保守序列基序

       對小鼠J元件序列分析中，發(fā)現(xiàn)了一些同源位點和O/E-like位點，并且這些位點所在的430bp區(qū)域是人類和小鼠最高同源區(qū)域，是“J元件核心”。H、P增強子中也存在類似的位點，表明J元件序列基序在I類OR基因表達(dá)中也起著重要作用。

       接下來將這430bp的J元件核心在無胎盤哺乳動物基因組比對，包括有袋類（負(fù)鼠，小袋鼠，袋獾）和單孔目（鴨嘴獸），顯示出以下保守基序：4個同源域位點，一個鄰近的O/E-like位點和一個保守基序（5‘-AAACTTTTC-3’），由于5‘-AAACTTTTC-3’ 基序非常保守，并且在H和P元件里并沒有出現(xiàn)，它對于J元件的特異性說明這個基序可能與I類基因表達(dá)特征的原因。識別與I類特異性保守序列基序結(jié)合的因子，將進(jìn)一步揭示依賴于J元件的I類OR基因表達(dá)的分子機制。

本文補充了單個OR等位基因表達(dá)的增強子依賴的調(diào)控模型：1、OSN選擇表達(dá)I類或II類OR基因中的一種，此時已經(jīng)固定了選擇；2、根據(jù)已經(jīng)選擇的OSN命運再隨機并特定于MOE特定區(qū)域的方式選擇功能性增強子元件；3、所選的增強子元件來選擇單個OR基因來表達(dá)。

總結(jié)：

本文作者鑒定出一種增強子元件，J元件，它是小鼠I類OR特異的，在從鴨嘴獸到人的哺乳動物中都保守。J元件可以調(diào)控大多數(shù)的I類OR，對整個I類OR基因簇超過3百萬個堿基產(chǎn)生影響。敲除一條鏈上的J元件可以增加另一條含有完整J元件鏈上的I類OR表達(dá)頻率，說明J元件的活性決定了I類OR的等位基因排斥。本文揭示了一個長距離順式調(diào)控元件（J元件）控制I類OR單基因表達(dá)，并在進(jìn)化過程中保守，保證了哺乳動物I類OR的單等位基因表達(dá)模式。