Construction of potential GlioblastomaMultiforme-related miRNA-mRNA regulatory network. Received: 12 September2018; Accepted: 28 February.

這篇文章發(fā)表在Frontiersin Molecular Neuroscience 

(2017-2018年影響因子3.9)

研究背景

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GlioblastomaMultiforme, GBM）是一種高度惡性的腫瘤，在所有腦腫瘤中最具侵襲性。GBM很少發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但其很容易侵犯周圍腦組織（認(rèn)為與其快速增殖有關(guān)）。目前針對(duì)GBM的治療手段還是很有限，一般是手術(shù)聯(lián)合放療+替莫唑胺，但是絕大部分患者最后還是復(fù)發(fā)，平均生存期只有12-18月左右。開發(fā)一種有效的治療策略能為GBM患者帶去福音。微小RNA是目前炙手可熱的研究領(lǐng)域，它在腫瘤中的強(qiáng)大作用也已被多方證實(shí)。但是，目前關(guān)于微小RNA在GBM中的研究還不是那么充分。因此，找到一些能在GBM發(fā)生過程中起作用的微小RNA可能能夠找到一些有效的治療靶點(diǎn)，從而提高患者生存期并改善預(yù)后狀況。況且，眾多其他領(lǐng)域（外泌體、自噬、免疫以及其他ncRNA）與微小RNA也都存在交叉，當(dāng)前開展的這一研究能為這些領(lǐng)域提供部分提示。

主要研究內(nèi)容

1、篩選差異miRNAs

首先，在GEO數(shù)據(jù)庫中查找可分析數(shù)據(jù)集，檢索詞：(（GBM）or (Glioblastoma Multiforme)) AND ((microRNA) or (miRNA))。然后進(jìn)一步瀏覽篩選，找到GSE90603。隨后，進(jìn)行分組分析，總共分成4組，包括一個(gè)腫瘤組(A.16個(gè)GBM樣品)以及三個(gè)正常組（B.GBM癌旁正常組織4例；C.非GBM患者正常腦組織3例；D.B+C,共7例）。A與B\C\D依次做差異分析（GEO2R）。最后，三個(gè)分析結(jié)果作交集（veendiagram）

2、預(yù)測(cè)調(diào)控差異miRNAs的上游轉(zhuǎn)錄因子

miRNA的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控已經(jīng)被證實(shí)，這里我們用FunRich軟件預(yù)測(cè)了調(diào)控這些差異miRNA的上游轉(zhuǎn)錄因子。下圖只展示前十。

3、預(yù)測(cè)差異miRNAs的下游靶基因

MiRNA發(fā)揮生物學(xué)功能主要是通過負(fù)向調(diào)控下游基因的表達(dá)，因此我們預(yù)測(cè)了差異miRNA的下游靶基因，并構(gòu)建了miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖（如下圖A與C）。預(yù)測(cè)miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫有很多，我們這里采用了一個(gè)綜合性預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫-miRNet。這個(gè)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)結(jié)合總共收集了11個(gè)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)結(jié)果，所以預(yù)測(cè)的結(jié)果比較準(zhǔn)確。另外這個(gè)數(shù)據(jù)庫還具有強(qiáng)大的可視化分析功能。

當(dāng)然僅僅這樣的預(yù)測(cè)出來的靶基因結(jié)果準(zhǔn)確性往往會(huì)受到大家的質(zhì)疑。因此，在這里我利用了miRNA的負(fù)向調(diào)控靶基因的這個(gè)作用機(jī)制，并引入了TCGA數(shù)據(jù)庫中GBM的mRNA數(shù)據(jù)，并對(duì)其做差異分析，得到了一些差異的mRNA。如下：

最后，我將上調(diào)（下調(diào)）的miRNA分子預(yù)測(cè)出的靶基因與下調(diào)（上調(diào)）的mRNA分子作交集分析，從而篩選出可靠的靶基因（在supplementdata中）。

4、靶基因富集分析及蛋白互作分析

接下來，常規(guī)操作，對(duì)篩選的這些靶基因做GO功能注釋以及KEGG通路富集分析。能做富集分析的網(wǎng)站挺多，包括：DAVID，PANTHER,Gene Ontology以及Metascape等等。這里，我用的是另一個(gè)數(shù)據(jù)庫-Enrichr。這個(gè)數(shù)據(jù)庫我在之前的推文中有提及，它有兩大優(yōu)勢(shì)：1）數(shù)據(jù)更新快；2）分析結(jié)果可視化呈現(xiàn)（下圖就是數(shù)據(jù)庫直接生成）。大家平時(shí)也可以多用用。

然后，富集分析還是不夠，只能提示我們這些基因富集在哪些通路中，給我們后續(xù)研究提供參考。我們接著構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（STRING數(shù)據(jù)庫）以及篩選樞紐基因（cytoscape-CytoHubba）這個(gè)是什么呢？。下表，分別展示上調(diào)和下調(diào)10個(gè)（根據(jù)nodedegree）。

Table3. Hubgenes in the PPI networks.【仔細(xì)研究一下】

5、miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在我們這個(gè)研究中，我們不同于別人，直接構(gòu)建所有差異miRNA與所有候選靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)。我們采用了上述篩選的20個(gè)樞紐基因作為網(wǎng)絡(luò)的根（mRNA）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們之前的分析的結(jié)果準(zhǔn)確，我們進(jìn)一步用GEPIA這個(gè)數(shù)據(jù)庫【這個(gè)是什么？】（優(yōu)勢(shì)：正常腦組織比TCGA多，分析結(jié)果更準(zhǔn)確）來驗(yàn)證這20個(gè)基因在GBM中的表達(dá)情況，如下（只有TRPC5的表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是表達(dá)的趨勢(shì)還是跟之前分析一致）

接著，我們?cè)俳Y(jié)合之前在miRNet中構(gòu)建的miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)，篩選出網(wǎng)絡(luò)的葉（miRNA）。然后利用cytoscape和PPT構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，如下：

6、預(yù)后分析進(jìn)一步篩選

最后，我們還進(jìn)一步地評(píng)估了網(wǎng)絡(luò)中的20個(gè)mRNA在GBM中的預(yù)后作用。發(fā)現(xiàn)EGFR，PPP3CB以及MYO5A具有顯著作用，如下：

Table 4. Theassociation of hub gene expression and the survival in patients with GBM.

整篇文章分析大概如此，大家看完應(yīng)該都明白了。不過這篇文章還是存在一些不足之處的：1）篩選差異miRNA以及差異mRNA最好使用相同的標(biāo)本，可惜TCGA中沒有GBM的miRNA數(shù)據(jù)，而GEO中篩選的這個(gè)數(shù)據(jù)集又只做了mRNA芯片；2）miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中的miRNA在GBM中的預(yù)后作用沒有評(píng)估，因?yàn)槿狈CGA缺乏GBM的miRNA數(shù)據(jù)；3）我本身不是神經(jīng)外科專業(yè)，拿不到相應(yīng)的臨床組織標(biāo)本，本來篩選出的這個(gè)miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下，然后從中篩選幾個(gè)再深入研究，整篇文章還可以再上一個(gè)檔次。當(dāng)然里面有些分析的小細(xì)節(jié)處理大家還是需要注意，例如：篩選差異miRNA時(shí)的分組。大家有興趣的話可以去仔細(xì)看看文章的“Materialsand methods”部分。   

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