今天早上看到一則新聞?wù)f山東省已經(jīng)頒發(fā)關(guān)于保護(hù)月經(jīng)期女性的3條建議，如果診斷痛經(jīng)或月經(jīng)過多，可以申請(qǐng)休息。好人性化的規(guī)定啊。也不知重慶會(huì)不會(huì)實(shí)行。(果子：這是因?yàn)橐v細(xì)胞周期讓你跳轉(zhuǎn)到了月經(jīng)周期么？)

昨天是正式工作的第一天，果子老師總是可以幫我解決一些現(xiàn)下的麻煩，總是可以給我一些耳目一新的東西。昨天我們主要談到了兩個(gè)主題，一個(gè)是關(guān)于轉(zhuǎn)染問題。一個(gè)是關(guān)于上次他看的文獻(xiàn)，有關(guān)不用抗體就可以做WB的文章，這也是刷新我的認(rèn)知啊。但是我對(duì)CRISPER-Cas9的認(rèn)識(shí)還不夠，所以決定這一周，最遲下一周要把這個(gè)東西搞明白。我已經(jīng)決定課題組內(nèi)下周文獻(xiàn)分享就分享果子老師推薦的那篇文獻(xiàn)，希望我也有所得到，到時(shí)和大家分享。

在分享今天的內(nèi)容之前，先跟大家聊聊有關(guān)preprint的一個(gè)事。相信很多人也是第一次聽到preprint這個(gè)詞。以下來自于維基百科的解釋：預(yù)印本（Preprint）也稱未定稿本。在學(xué)術(shù)出版領(lǐng)域，預(yù)印本是指尚未在需要同行評(píng)審的科學(xué)期刊上出版的科學(xué)文獻(xiàn)的草稿。

作者在寫作完成后，便可將草稿預(yù)先公開讓大家閱讀并提出更改建議，在更改后可以提交相應(yīng)學(xué)術(shù)期刊進(jìn)行出版。
這個(gè)東西有好也有壞（以下言論均是我的理解，以供參考） 。

• 好處就是，在你的文章投遞一些雜志后，總是不能送外審，總是被拒，那你可以選擇preprint，這樣只要有做相關(guān)領(lǐng)域的人均可搜索到你的文章進(jìn)行閱讀，并給你意見進(jìn)行修改，你可以和那些人討論，一起修改?？傊€可以。這樣也可以避免惡意審稿，以及知識(shí)產(chǎn)權(quán)、專利的問題。

• 當(dāng)然缺點(diǎn)也很多，并不是所有雜志均接收preprint的文章，所以你在選擇preprint之前要看自己心儀的雜志是否接收這種形式，比如science就不接收預(yù)印本的文章。另外就是害怕你把你的創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)post出來，會(huì)有人跟著你這個(gè)做，并且超越你的進(jìn)度。

上周剛遞了一篇preprint。

好了，今天我主要分享細(xì)胞周期的檢測方法。

細(xì)胞周期(我記得這個(gè)名詞解釋在高中生物時(shí)是必考的)是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。如下圖：

• G0期：這一期的細(xì)胞稱為休眠細(xì)胞，暫時(shí)脫離細(xì)胞周期,不進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下重新開始DNA合成, 進(jìn)行細(xì)胞分裂。

• G1 期：主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。

• S期：這個(gè)時(shí)期主要合成DNA, 同時(shí)還會(huì)合成組蛋白, DNA復(fù)制所需的酶都在這一時(shí)期合成。

• G2期：這一時(shí)期是DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微絲微管蛋白。

• M期：這個(gè)時(shí)候RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 以及染色體高度螺旋化。

其實(shí)高中生物還是挺有用的，你了解清楚每個(gè)時(shí)期主要合成的是什么，

• 在做電鏡時(shí)你就可以認(rèn)出你的細(xì)胞處于什么時(shí)期，

• 以及在做藥物實(shí)驗(yàn)時(shí)，為什么要饑餓細(xì)胞24小時(shí)。

在我們做的一個(gè)負(fù)鏈RNA病毒感染的細(xì)胞模型中，大部分感染細(xì)胞的細(xì)胞周期都停留在G0/G1期，這就是因?yàn)樗且粋€(gè)RNA病毒，在感染早期得先抑制宿主的轉(zhuǎn)錄水平，然后促進(jìn)自己的負(fù)鏈變?yōu)檎淩NA，進(jìn)行翻譯。

當(dāng)然這些過程有可能沒有嚴(yán)格的先后順序，同時(shí)進(jìn)行。它為什么會(huì)讓細(xì)胞停留在G0/G1期呢，還有主要是病毒的哪個(gè)蛋白發(fā)揮了這些作用呢，調(diào)控了宿主細(xì)胞的哪個(gè)周期蛋白或者酶呢，這些都是我要問的問題及接下來的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

下面開始分享流式細(xì)胞術(shù)檢測PI染色細(xì)胞的方法。

細(xì)胞周期檢測可以自己購買碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），自己染色，也可以買現(xiàn)成的試劑盒。

先分享自己配置的PI，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

PI染色的原理：

在不進(jìn)行細(xì)胞通透時(shí)，PI不能進(jìn)入有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞也就是正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。而壞死的細(xì)胞或者處于焦亡狀態(tài)下的細(xì)胞，由于細(xì)胞膜完整性遭到破壞，所以PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI可以鑒別壞死、焦亡細(xì)胞。

做細(xì)胞周期的原理就是，根據(jù)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的DNA 含量不同（也就是我們高中學(xué)的在不同時(shí)期DNA是幾個(gè)N那個(gè)東東）。通常正常細(xì)胞的G0/ G1 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量（2N），G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量（4N） ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之間。細(xì)胞75%冰乙醇固定通透后PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，可以用流式細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時(shí)，便可將細(xì)胞周期區(qū)分為G1/G0 期，S 期和G2/M 期,這樣可以得出各個(gè)時(shí)期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

下面是自己配置PI染色?？梢宰约号渲?，用1XPBS配置，儲(chǔ)存濃度為1 mg/mL。

• 1.懸浮細(xì)胞直接離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2-3次（貼壁細(xì)胞，棄上清后，常規(guī)消化后，離心棄上清后，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2-3次）。

• 2.加入預(yù)冷70%乙醇，室溫固定1h或者4℃固定過夜，再或-20℃長期固定（最長做過-20℃固定了45天）。個(gè)人建議最好盡快檢測。如果取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可以每個(gè)時(shí)間取回來后-20℃固定等最后一次固定完了一塊測。

• 3.細(xì)胞染色
  離心收集細(xì)胞，以1mL的PBS洗細(xì)胞2次。加入500uL濃度適宜的PI（一般為10-20ug/mL每1萬個(gè)細(xì)胞）（稀釋用冰PBS），現(xiàn)加100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100。 4℃或者避光孵育30-50min或者室溫20min 。
  棄上清后，以1mL的PBS洗細(xì)胞2次后，用500uLPBS混勻細(xì)胞，待流式檢測。

• 4.流式分析