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圖片來源：pixabay 1.primers design 這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件： 1)足夠長(zhǎng)，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長(zhǎng)越好，太長(zhǎng)的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量； 2)GC%，40%~60%； 3)5'端和中間序列要多G/C，以增加穩(wěn)定性； 4)避免3'端GCrich，最后5個(gè)堿基不要多于2個(gè)G/C； 5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER； 6)避免3'端的錯(cuò)配； 7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)； 8)附加序列(RTsite，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)要加上它們； 9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)； 10)最好學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Onlinedesign et al. 圖片來源：pixabay 靈敏度指的是PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠檢測(cè)到目的基因最小值。研究結(jié)果表明，影響PCR擴(kuò)增效率的因素，如，模板的復(fù)雜程度與完整性、引物純度及其與模板結(jié)合效率、反應(yīng)溫度、DNA的熱穩(wěn)定性與擴(kuò)增性能、反應(yīng)緩沖液的離子組成（主要指：陽離子）、反應(yīng)優(yōu)化劑等，均決定PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度。在最佳擴(kuò)增條件下，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)到pg(10-12g)數(shù)量級(jí)目的基因。對(duì)于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系（包括：DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等）就是研究者提高PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度的關(guān)鍵因素了。 與實(shí)驗(yàn)室自配PCR擴(kuò)增體系相比，東盛PCR Mix對(duì)反應(yīng)緩沖液中的成分進(jìn)行了優(yōu)化，并加入了適當(dāng)比例的反應(yīng)增強(qiáng)劑（PCREnhancer），提高了DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR擴(kuò)增性能的影響，使得DNA聚合酶處于最適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高的檢測(cè)靈敏度。即使反應(yīng)體系中只有幾個(gè)目的基因拷貝，也能輕松檢測(cè)。 |
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