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隨著去除核糖體測序技術(shù)深入發(fā)展，越來越多的環(huán)狀RNA（circRNA）不斷報道發(fā)現(xiàn)，基于生物信息學分析顯示circRNA發(fā)揮著極其重要的生物學功能。然后如何采用實驗手段進一步驗證circRNA的生物學功能顯得尤為重要，本文帶大家一起探討circRNA功能驗證策略。 1. circRNA定量驗證 circRNA定量驗證手段與常規(guī)PCR手段不同，常規(guī)手段是圍繞目的片段的上下游分別設(shè)計PCR引物，稱之為convergent primer，需擴增的片段位于上下游引物之間（如圖1.1）。而對于circRNA，尤其外顯子環(huán)化circRNA，除backsplice junction位點處不同于linear RNA之外，body區(qū)與linearRNA是一致的。因此，驗證時需要特異性針對backsplice junction位點處設(shè)計primer，稱之為divergent primer（如圖1.1），而且設(shè)計的PCR product的長度越短越好，可以增強backsplice junction位點處擴增效率。
為增強circRNA的驗證效率，起始模版需滿足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。 驗證策略：對3free RNA以及genome DNA同時進行PCR擴增，電泳檢測PCR product大小（如圖1.2）。
圖1.2 circRNA引物擴增結(jié)果 2. circRNA Northern blot驗證 Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗證方法，需圍繞circRNA設(shè)計探針序列，而探針序列設(shè)計是驗證成功至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。對于circRNA探針設(shè)計，我們建議以下兩點：1. 對于外顯子環(huán)化circRNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點；2.對內(nèi)含子環(huán)化circRNA，可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計探針。 驗證策略：對3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時進行雜交驗證。 3. circRNA過表達 circRNA過表達思想主要源于circRNA生物形成機制，已有多篇文章報道circRNA成環(huán)機制，目前比較公認的成環(huán)機制為circRNA側(cè)翼序列的堿基互補配對，稱之為Alu結(jié)構(gòu)（如圖2）。
基于circRNA側(cè)翼Alu序列特征，PCR擴增含側(cè)翼Alu序列的目標DNA序列，隨后依據(jù)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點進行酶切，進而連接pEGFP-C1載體。連接載體進而轉(zhuǎn)染對應(yīng)細胞樣本，定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率?；赿ivergent primer驗證circRNA過表達倍數(shù)。 過表達策略：1. 擴增目標區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補序列，側(cè)翼上下游1kb處過表達效率更佳；2. 目標區(qū)域擴增基于基因組DNA為模版。 4. circRNA敲除 circRNA敲除思路主要針對circRNA backsplice junction處序列信息設(shè)計siRNA，對于內(nèi)含子環(huán)化circRNA，也可針對內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計相應(yīng)siRNA進行干擾。Divergent primer驗證circRNA敲除倍數(shù)。 敲除策略： 1. 外顯子環(huán)化circRNA，針對backsplice junction位點前后序列設(shè)計siRNA，如圖3所示； 2. 內(nèi)含子環(huán)化circRNA，除針對backsplice junction位點前后序列設(shè)計siRNA序列以外，也可針對內(nèi)含子區(qū)域序列設(shè)計siRNA。 3. 每個siRNA設(shè)計對應(yīng)的對照，backsplice junction位點一端互補配對，另一端錯配，如圖3所示。
參考文獻 1. New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585. 3. RNA (2013) 19:141–157. 4. Cell Reports (2015) 10, 170–177. 來源:聯(lián)川生物技術(shù)公司
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