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做完甲基化測序后（當(dāng)然不止是甲基化測序，也適用于其他測序）需要對分析結(jié)果中感興趣的基因進(jìn)行生物學(xué)功能驗證，包括分子實驗、病毒包裝、細(xì)胞水平驗證、動物水平驗證等。 基因驗證 分子實驗：質(zhì)粒構(gòu)建（普通基因、microRNA、lncRNA、Cas9、點突變、啟動子）等。 病毒包裝：慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒 細(xì)胞水平：穩(wěn)定株構(gòu)建、蛋白與蛋白互作（BioID、GST pull down）、細(xì)胞表型實驗（周期檢測、凋亡檢測、克隆形成、侵襲、遷移）、靶基因驗證等 動物水平：皮下成瘤、轉(zhuǎn)基因鼠、活體成像、免疫組化、免疫熒光、HE染色等 詳情請咨詢和元上海，021-31601005 客戶案例 摘要： 近年來，RNA水平的表觀遺傳修飾因其重要的病理生理功能越來越受到研究人員的重視。其中RNA的甲基化(m6A，N6-methyl-adenosine)修飾作為轉(zhuǎn)錄后修飾的一種成為最重要的研究靶點。但是RNA的甲基化修飾對于癌癥特別是肝癌的發(fā)生發(fā)展及作用目前還不是很清楚。 孫樹漢課題組在男女各20例肝癌樣本中利用q-PCR的方法檢測目前已知的RNA甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在肝癌中顯著下調(diào)。干擾METTL14后，利用dot blot和Northern blot方法，發(fā)現(xiàn)整體RNA甲基化水平也明顯降低。通過細(xì)胞功能學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)表達(dá)的METTL14能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。在干擾METTL14的細(xì)胞系中，p21及其他細(xì)胞周期相關(guān)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，并且這些基因包含有數(shù)據(jù)庫中的RNA甲基化位點。 在尋找影響METTL14表達(dá)的因素時，IL1β能夠明顯下調(diào)METTL14的表達(dá)。結(jié)果表明METTL14在肝癌中下調(diào)表達(dá)并且可能通過RNA甲基化修飾影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，METTL14以及RNA甲基化修飾對于肝癌的發(fā)展具有重要的作用。慢病毒由和元上海提供。 詳情 ↓ 1. 原發(fā)性肝細(xì)胞癌HCC中存在m6A修飾異常 作者首先使用酶標(biāo)儀對肝癌組織、癌旁組織以及正常組織中m6A的整體水平進(jìn)行了檢測，試劑盒（The m6A RNA methylation quantification kit, Abcam）原理與ELISA相似。同樣，去除rRNA后，m6A水平也顯著降低。結(jié)果表明，在HCC中無論是mRNA還是rRNA，整體m6A水平顯著降低。 2. METTL14引起HCC中m6A水平異常 下一步，作者對幾種常見的甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶進(jìn)行了qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)METTL14和FTO這兩個基因在HCC中表達(dá)量顯著降低。接下來，作者又對130個HCC隊列病人的肝癌組織和癌旁組織進(jìn)行了驗證發(fā)現(xiàn)基本符合趨勢。另外，F(xiàn)TO與METTL14也具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2=0.4789。 接下來，作者對FTO和METTL14做了細(xì)胞定位后發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白都位于細(xì)胞核中，但是兩者并不互作。敲低和過表達(dá)METTL14后，F(xiàn)TO表達(dá)量并沒有受到顯著影響。作者推測FTO在HCC中顯著降低可能是由于METTL14引起的m6A水平降低后的feedback。 下一步，作者研究了甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一種蛋白METTL3后發(fā)現(xiàn)，METTL3會導(dǎo)致HCC細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。但是在HCC病人中，METTL3的表達(dá)水平卻有所降低。這個結(jié)果表明METTL3在HCC中復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。 作者使用siRNA對SMMC-7221細(xì)胞和hep3B細(xì)胞進(jìn)行METTL14敲低。斑點雜交結(jié)果表明m6A整體水平下降。對METTL14敲除的細(xì)胞進(jìn)行METTL14過表達(dá)補(bǔ)救后發(fā)現(xiàn)m6A水平恢復(fù)正常。 所以作者認(rèn)為HCC中m6A修飾水平異常的主要因素之一便是METTL14。 3. METTL14下調(diào)引起肝癌轉(zhuǎn)移 METTL14的水平隨著肝炎、肝硬化以及HCC逐漸顯著降低，這表明METTL14與HCC的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。針對130人HCC隊列研究表明，METTL14表達(dá)量降低更易引起高頻復(fù)發(fā)且生存周期降低。 后續(xù)分析表明，METTL14不僅與HCC的分化及腫瘤周期相關(guān)，還與腫瘤微衛(wèi)星、微血管轉(zhuǎn)移（microvascular invasion）等相關(guān)。HCC轉(zhuǎn)移首先會引起門靜脈癌栓（PVTT），作者在PVTT、轉(zhuǎn)移瘤HCC和非轉(zhuǎn)移瘤HCC中檢測了METTL14的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，PVTT中METTL14表達(dá)量顯著降低且轉(zhuǎn)移瘤中m6A水平低于非轉(zhuǎn)移瘤。這表明METTL14還與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)。 作者在其他幾種腫瘤中也對METTL14水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明METTL14在乳腺癌中表達(dá)水平顯著降低，且生存周期降低。作者推測METTL14可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移在功能上相似。
另外，METTL14在HCC中顯著降低也與性別、乙肝病毒抗原以及微血管轉(zhuǎn)移相關(guān)，METTL14與病人生存周期相關(guān)。METTL14作為潛在的預(yù)后marker與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)。 4. METTL14敲除導(dǎo)致HCC轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)
作者在SMMC-7221細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞中進(jìn)行了METTL14 siRNA干擾。結(jié)果在METTL14敲除后，這些細(xì)胞的遷移（migration）和侵染（invasiveness）顯著增強(qiáng)。劃痕實驗表明也表明METTL14作為一種負(fù)調(diào)控蛋白與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)。 下一步作者構(gòu)建了METTL14敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株（帶熒光報告基因）并將其注射進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移模型鼠后發(fā)現(xiàn)，METTL14缺失能夠促進(jìn)腫瘤生長，并在肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)更為惡化的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。最后，作者還在發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移的小鼠模型中注射METTL14缺失的SMMC-7221細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)METTL14缺失會導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移惡化。 5. 過表達(dá)METTL14在HCC中抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移
與上一個實驗相反的是，作者在這里對METTL14進(jìn)行過表達(dá)后進(jìn)行一系列細(xì)胞表型實驗。下一步構(gòu)建了METTL14穩(wěn)定細(xì)胞株后注射進(jìn)腫瘤模型鼠中。無論是細(xì)胞實驗還是動物模型實驗，METTL14過表達(dá)都會顯著降低腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移水平。 6. METTL14介導(dǎo)m6A修飾通過與DGCR8互作調(diào)控miR-126加工
先前已有報道稱，DGCR8與METTL3互作，METTL3敲低會影響miRNA成熟的加工，顯著增加pri-miRNA的表達(dá)量。在本實驗中，作者對METTL14進(jìn)行了IP實驗后發(fā)現(xiàn)，METTL14與DGCR8互作且由RNA介導(dǎo)。METTL14敲除或敲低顯著影響miRNA成熟體的表達(dá)水平，pri-miRNA表達(dá)水平上升。這些數(shù)據(jù)與已發(fā)布的miRNA芯片數(shù)據(jù)相符合。 作者找到了關(guān)鍵的miR-126成熟體顯著降低。已知miR-126能夠抑制HCC轉(zhuǎn)移，這個現(xiàn)象在METTL14缺陷的細(xì)胞中通過miR-126 mimics進(jìn)行表型補(bǔ)救。 在44對肝癌病人中對miR-126進(jìn)行了qPCR驗證后發(fā)現(xiàn)，HCC中miR-126表達(dá)量顯著降低。此外，METTL14表達(dá)量還與miR-126相關(guān)，R2=0.439。 在HCC中，miR-126成熟體加工由甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL14介導(dǎo)，miR-126成熟體表達(dá)量降低會引起HCC轉(zhuǎn)移。 |
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