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明明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，我卻看上去沒(méi)差異，這就是我和明明的差別！
在上一節(jié)中我們介紹了最基本的qPCR分析結(jié)果分析，可以在訂閱號(hào)的“歷史記錄”里面看到，也可以登錄www.查看。在這一節(jié)中我們介紹第二個(gè)案例：癌和癌旁的差異。現(xiàn)在有20對(duì)病人某腫瘤組織標(biāo)本，每對(duì)組織有癌（T）和癌旁（N）兩個(gè)組織，我們想看基因A的mRNA水平在癌和癌旁中是否有差異？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果對(duì)20對(duì)標(biāo)本（40個(gè)組織）分別采用提取組織mRNA的方式，protocol可以在科研狗網(wǎng)站http://www. 中找到，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR過(guò)程和注意事項(xiàng)我們會(huì)在另外一個(gè)專(zhuān)題中介紹。進(jìn)行qPCR之后我們會(huì)得到如下結(jié)果（只展示了第一對(duì)和第二對(duì)標(biāo)本組織，T1代表第一個(gè)對(duì)的癌組織，N1代表第一對(duì)的癌旁組織）：然后我們做完20對(duì)組織的qPCR之后，整理數(shù)據(jù)得到如下結(jié)果：
按照上一次案例1里面的統(tǒng)計(jì)方法去畫(huà)圖，
如果我們按照上一次案例1里面的統(tǒng)計(jì)方法去做，先求出N（癌旁）2^-△Ct的平均值n1，然后用T(癌) 2^-△Ct分別除以n1，再用每個(gè)N（癌旁）2^-△Ct處理n1，就得到了最終可以統(tǒng)計(jì)的結(jié)果T(癌) 2^-△△Ct，和N（癌旁）2^-△△Ct，具體計(jì)算過(guò)程就不羅列了，整理結(jié)果如下： 如果接著作圖，會(huì)出現(xiàn)如下結(jié)果：你是不是嚇一跳，癌和癌旁是不是沒(méi)差異了？
但是仔細(xì)一看，從數(shù)據(jù)角度看來(lái)所有的癌里面A的表達(dá)水平都比癌旁低啊，為什么做到這個(gè)圖上面，看上去這么不可能呢。
那么問(wèn)題究竟出在哪里呢？
首先上一節(jié)中我們是三次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)于同一種藥物作用于同一種細(xì)胞相同的時(shí)間，理論上三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)中藥物引起p53 mRNA水平的變化是確定的，而在本案例中，不同病人之間的標(biāo)本不能算作是實(shí)驗(yàn)重復(fù)，不同個(gè)體之間的A基因mRNA水平也是不一樣的。因此，不能采用案例1中的計(jì)算方式。
下面首先介紹下我們常用的模式：
我們用每組的T(癌) 2^-△Ct除以N（癌旁）2^-△Ct，得到T(癌) 2^-△△Ct，這樣一來(lái)，N（癌旁）2^-△△Ct都為1，然后整理結(jié)果得到如下：這個(gè)是不是比第一次柱形圖好看？
但是這種做法其實(shí)是有問(wèn)題的，雖然看上去差異比較大（通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算差異也比較大），但是N（癌旁）已經(jīng)沒(méi)有誤差，這是不科學(xué)的。所以在本文中，科研狗認(rèn)為應(yīng)該以T(癌) 2^-△C和N（癌旁）2^-△Ct做成散點(diǎn)圖，如下所示（注意不是△△），如果你有更好的想法可以告訴我們一起交流學(xué)習(xí)。可以看出，在癌旁組散點(diǎn)圖位置均上移。我們通過(guò)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析兩組之間的差異：采用配對(duì)T檢驗(yàn)（T檢驗(yàn)的前提是樣本服從正太分布，可以提前檢測(cè)下，一般測(cè)定某一個(gè)蛋白或者mRNA的水平，可以看作是正態(tài)分布）。
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