qPCR的數(shù)據(jù)相對(duì)定量分析其實(shí)很簡單。我做了很多的qPCR實(shí)驗(yàn)，也看了很多的資料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商業(yè)化軟件使用的教程及教程里面記述的原理。

我在這里跟大家分享一下自己的經(jīng)驗(yàn)，最常用，最普遍的相對(duì)定量方法就是2^-△△Ct法，該法最最簡單的說就是：

首先將一次實(shí)驗(yàn)的所有基因Ct值整理好，之后用每一組樣本自身的目的基因Ct值減去自身內(nèi)參基因Ct值，得到的數(shù)就是△Ct；換成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；

然后，將每一組樣本每一個(gè)目的基因的△Ct都算好，整理進(jìn)Excel，用本次實(shí)驗(yàn)中待研究樣本的△Ct減去對(duì)照組樣本的△Ct，并同時(shí)對(duì)所有結(jié)果取相反數(shù)（就是加一個(gè)負(fù)運(yùn)算，正數(shù)就變成負(fù)數(shù)，負(fù)數(shù)就變成正數(shù)），該步運(yùn)算得到的結(jié)果就是-△△Ct。

最后，對(duì)-△△Ct進(jìn)行2的冪運(yùn)算，即2^-△△Ct就得出Fold Change。

但是，我想說的是2^-△△Ct得出的是Fold Change，不僅數(shù)據(jù)結(jié)果看上去不直觀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因mRNA的情況，同時(shí)還具有放大效應(yīng)，所謂放大就是本來A基因的-△△Ct得到為2，B基因-△△Ct為4，兩者相差2，經(jīng)過2的冪運(yùn)算之后，A基因?yàn)?，B基因?yàn)?6，兩者相差12！

· 相對(duì)定量本身就存在放大的情況，若是再采取2^-△△Ct就只能說看看趨勢而已了，所以我在這里給大家推薦ABi官方的一個(gè)分析方法，就是log2R，就是log2為底對(duì)R求對(duì)數(shù)。當(dāng)相對(duì)定量分析時(shí)，默認(rèn)擴(kuò)增效率E趨近或等于100%，這時(shí)候R就是2^-△△Ct，當(dāng)然原本的R的公式我會(huì)在后面附上，感興趣的朋友可以自己去推導(dǎo)。

所以，我用的方法就是只計(jì)算到-△△Ct這一步就夠了，這樣得到的數(shù)據(jù)就有了正值與負(fù)值，正值表示較對(duì)照組mRNA上調(diào)，負(fù)值表示較對(duì)照組mRNA下調(diào)，作出圖來非常直觀，一目了然，也沒有放大效應(yīng)，顯著性分析較為靠譜。這種運(yùn)算方法最關(guān)鍵的在于負(fù)號(hào)以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組要分清楚！要不就得到相反的結(jié)果。

附上R的完整公式： R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample)

其中，E1：目的基因引物擴(kuò)增效率；E2：內(nèi)參基因引物擴(kuò)增效率；△Ct1：實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值差；△Ct2：對(duì)照組目的基因Ct值差。 你觀察這個(gè)公式時(shí)候就發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擴(kuò)增效率E為1（即100%）時(shí)，該公式就等于2^-△△Ct，這就是為什么會(huì)有2^-△△Ct方法的原因?。?！ ABi官網(wǎng)里的一款商業(yè)軟件能直接給出每次試驗(yàn)每對(duì)引物的擴(kuò)增效率E，能得到較為實(shí)際的R值，所以ABi的商業(yè)軟件會(huì)對(duì)R進(jìn)行l(wèi)og2的運(yùn)算，進(jìn)而得到直觀的結(jié)果。