圖1： 理想情況下PCR產(chǎn)物與循環(huán)數(shù)關(guān)系

圖2 理論情況下PCR產(chǎn)物量與循環(huán)數(shù)關(guān)系。

圖3 實(shí)際情況下PCR產(chǎn)物數(shù)與循環(huán)數(shù)的關(guān)系

剛開始的時(shí)候酶，緩沖液，能量，dNTP等都是充足的，PCR按照理論情況下的擴(kuò)增（A: 指數(shù)期），限速因子為底物的量；

隨著時(shí)間的增加，產(chǎn)物越來(lái)越多，每次循環(huán)所需要的酶也就越來(lái)越多，當(dāng)達(dá)到B（線性期）階段的時(shí)候，所有的酶都參與了擴(kuò)增，因此每個(gè)循環(huán)之后產(chǎn)物增加量是恒定的，和酶的數(shù)量相關(guān)，此時(shí)限制產(chǎn)物增加的因素是酶；

當(dāng)達(dá)到C（衰退期）階段時(shí)候，酶逐漸失活，dNTP消耗殆盡，產(chǎn)物增加量逐漸減少；

直至到D階段，沒有任何產(chǎn)物生成，數(shù)目保持恒定。

我們可以將每條PCR產(chǎn)物帶上一個(gè)熒光標(biāo)記（具體怎么回事下節(jié)講解），這樣的話有多少個(gè)PCR產(chǎn)物就有多少單位的熒光，因此：

熒光 正比于 DNA產(chǎn)物數(shù)目 某種關(guān)系于 DNA初始量

因此我們通過機(jī)器收集熒光的量就能知道DNA初始量了，那么機(jī)器如何收集熒光呢？

圖4 固定循環(huán)數(shù)測(cè)定熒光強(qiáng)度值

圖5 固定熒光強(qiáng)度測(cè)試循環(huán)數(shù)

只要我們把R0設(shè)置合適，R0這條水平線就能切割到所有的處于對(duì)數(shù)期的曲線，我們qPCR采用的就是這種模式，下面我們來(lái)看下為什么這種模式能夠反映出DNA初始量（以下推導(dǎo)中l(wèi)g代表以2為底的對(duì)數(shù)）。

一大波推導(dǎo)公式來(lái)襲~可直接看最后公式

如果你有一個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，那么實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的比值就是2^-△△Ct，意思就是說實(shí)驗(yàn)組的mRNA水平是對(duì)照組的多少倍（Fold change）。

那么為什么不能用圖4（固定循環(huán)數(shù)，測(cè)最終熒光強(qiáng)度值）的方式來(lái)衡量初始濃度呢？那是因?yàn)楣潭ㄑh(huán)數(shù)的情況下，有很多樣品不處于對(duì)數(shù)期，熒光的量與初始濃度沒有特定的關(guān)系，無(wú)法計(jì)算初始濃度。

好了，不知道你是否已經(jīng)明白其中的原理，我們下一節(jié)將介紹qPCR儀器運(yùn)行的原理，讓你真正理解qPCR~

“這哪是最清晰的QPCR講解??？”

“客官請(qǐng)息怒，科研狗會(huì)努力做好，希望提出寶貴意見！汪汪汪”