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親愛的各位小伙伴，我們又見面啦~過去的一周，大家是不是沉浸在“追劇”的狂熱情緒中無法自拔了呢？
畢竟，《人民的名義》真的是好看又燒腦，引得廣大群群眾紛紛參與到熱烈的劇情討論中。
以至于小編上個微博，才剛摸到搜索欄還沒開始打字，就跳出了這樣的一串內(nèi)容：
在同一PCR反應中實現(xiàn)兩個或更多基因序列的擴增和特異性檢測，隨之而來的是豐富的實驗可能性，簡直不要太引人入勝~
那么，接下去，就讓我們來系統(tǒng)地了解一下“多重實時熒光定量 PCR”吧~
▼ 多重反應簡介 PCR 多重反應是指在同一個反應中實現(xiàn)兩個或更多基因序列的擴增和特異性檢測。要獲得成功，PCR 多重反應必須能夠生成針對目的序列的足夠的擴增產(chǎn)物。多重實時熒光定量 PCR 可同時產(chǎn)生定性和定量的結(jié)果。對于多重熒光定量PCR，所有的目的序列的擴增必須能產(chǎn)生足夠的指數(shù)期信號。對于定性結(jié)果，如果擴增產(chǎn)物足夠，也可利用終點檢測方法 (如凝膠電泳) 檢測所有目的序列。
后綴“plex”可用于多個術(shù)語。單重 (Singleplex) 反應是一種旨在擴增單個基因序列的分析。雙重 (Duplex) 反應是兩個PCR 反應的組合，旨在同時擴增兩個基因序列。多重反應最常見的類型是雙重反應，它是在同一孔內(nèi)進行靶基因和對照或標準品基因序列分析；多于兩重的更多重的反應也是可實現(xiàn)的。
一些商品化的實時熒光定量 PCR 試劑盒就是作為多重反應進行設計和驗證的。例如，MicroSEQ? E.Coli O157:H7試劑盒采用了內(nèi)部陽性對照和大腸桿菌 靶點多重反應。在研究應用領(lǐng)域，通常由科學家來選擇采用哪種多重反應分析，并負責多重反應的驗證。在考慮是否建立多重反應分析時，權(quán)衡多重反應與所需的驗證工作的利弊至關(guān)重要。 多重反應的三個優(yōu)點：更高的通量 (每塊反應板可分析更多樣本)、更低的樣本用量和試劑用量——取決于實驗中的靶點數(shù)。例如，如果定量實驗中只包括一個靶點分析，在同一反應中加入標準品分析，如內(nèi)參，進行雙重反應靶點分析將提高2倍的通量，同時每個樣本減少一半的樣本用量和試劑用量。但如果定量實驗包括兩個靶點分析，可將兩個靶點反應與一個標準品反應組合成三重反應。在這種情況下，樣本用量和試劑用量將進一步降低。 如果同時進行靶點和標準品多重反應，則多重反應還具有另一個優(yōu)點——使加樣精度錯誤最小化。同一孔的靶點和標準品數(shù)據(jù)來源于一次加樣，因此任何加樣精度錯誤應對靶點和標準品結(jié)果具有同等影響。為獲得精度優(yōu)勢，必須采用同一孔的標準品數(shù)據(jù)對靶點數(shù)據(jù)進行標準化，然后計算技術(shù)重復的精度。比較利用單重反應方式分析的數(shù)據(jù) (未經(jīng)過基于孔的標準化) 與利用多重反應方式完成的分析，證明多重反應的精度優(yōu)勢較大，具體取決于單重反應的錯誤。例如，對于單重反應精度錯誤極少的樣本，多重反應的精度優(yōu)勢也微乎其微。
對于需要更高精度的定量實驗，多重反應的精度優(yōu)勢顯得尤為重要。例如，在拷貝數(shù)變異實驗中，區(qū)分1拷貝基因與2拷貝基因是2倍差異，需要良好的精度。但區(qū)分 2 拷貝基因與 3 拷貝基因僅為1.5的差異，這需要更高的精度。對于此類型的實驗，推薦采用多重反應方法，其有助于達到該實驗所需的精度。 多重反應分析通常需要在同一孔內(nèi)加入多種染料。實時熒光定量 PCR 儀必須能夠準確地檢測同一孔內(nèi)的不同染料信號。這些測量必須保持針對各染料的特異性，即便當一種染料信號明顯高于其它信號時。 實時熒光定量 PCR 多重反應的最佳熒光試劑是那些可以指定不同染料來檢測多重反應中的各個基因序列的試劑。
絕大多數(shù)多重分析采用了多種染料、高特異性的試劑，如基于 TaqMan? 探針的 Assay。對于 RNA 多重反應分析，我們一般推薦兩步法 RT-PCR，而非一步法 RT-PCR。一步法 RT-PCR 要求逆轉(zhuǎn)錄和 PCR的引物濃度相同，降低了多重反應引物濃度的靈活性。而在兩步法 RT-PCR 中，可對 PCR 引物濃度進行多重反應優(yōu)化，且不會影響逆轉(zhuǎn)錄。 TaqMan? Multiplex Master Mix TaqMan? QSY?探針引入了專利的不發(fā)熒光的3' QSY淬滅基團，以便在多重檢測應用中充分提高PCR性能，在為您帶來TaqMan檢測所固有的靈敏度和特異性的同時，給您的real-time PCR檢測設計又增添一把利器。新開發(fā)的QSY淬滅基團可搭配FAM?、VIC?、ABY?和JUN?報告基團染料進行多重qPCR檢測。該QSY淬滅基團不發(fā)熒光，可降低本底干擾，同時提升淬滅效果。 TaqMan? QSY?探針 采用TaqMan? QSY探針進行多重檢測可以節(jié)省成本，減少樣品用量，同時還可以通過一次定量試驗，獲得堪比4次單管反應的結(jié)果。 單重反應的結(jié)果與多重檢測的結(jié)果相近。擴增圖顯示了4個EGFR探針進行單重(藍色)和4重反應擴增的檢測曲線線性度比例，試驗中每10μL反應物依次采用了按比例稀釋的20,000 pg至2 pg參照克隆cDNA。 假定采用的是多染料實時熒光定量 PCR 熒光試劑，則多重反應中各種基因序列的檢測將需要不同的報告基團染料。同一孔內(nèi)的報告基團染料必須被實時熒光定量 PCR儀充分激發(fā)并準確檢測。儀器生產(chǎn)商應能夠提供推薦染料。請注意，Applied Biosystems? 實時熒光定量PCR 預混液中包含一種紅色的參比熒光染料。僅帶有藍色激發(fā)光的儀器可充分激發(fā)基于ROX?染料的參比熒光染料，但藍色激發(fā)光一般不足以激發(fā)用作報告基團的紅色染料。 無需根據(jù)靶基因或基因產(chǎn)物的類型指定報告基團染料，但遵循染料的指定模式可簡化多重分析的構(gòu)建。例如，F(xiàn)AM? 染料是 TaqMan? 探針中最常用的報告基團染料。我們遵循其模式指定 FAM? 染料作為靶點分析的報告基團染料，并指定 VIC? 染料作為標準品分析的報告基團染料。采用此模式，可通過將不同的 FAM? 染料標記的靶點分析與相同的標準品分析 VIC? 染料進行配對，構(gòu)建多個雙鏈分析。進行三重分析時，可將第三種染料 ABY? 或JUN? 染料與 FAM? 染料和 VIC? 染料相結(jié)合。請注意，如使用 ABY? 染料，則在同一孔內(nèi)不應有 TAMRA? 染料存在，如果使用 JUN? 染料，MUSTANG PURPLE? 應該作為參考標準取代 ROX? 染料。 多重反應 PCR 飽和 多重反應 PCR 飽和是當豐度更高的基因擴增使熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶飽和時，多重分析中可能出現(xiàn)的不良現(xiàn)象，它抑制了較低豐度基因的擴增。飽和的補救措施是減少豐度更高的靶點的 PCR 引物的濃度，稱為“引物限制”。引物限制的濃度應足夠?qū)崿F(xiàn)幾何擴增，但需在 PCR 產(chǎn)物聚集到遏制較低豐度靶點擴增之前使引物耗竭。計劃多重分析時，研究人員應根據(jù) PCR 反應中各基因和基因產(chǎn)物的 DNA 或 cDNA 絕對豐度，識別多重反應中哪種基因或哪些基因有可能引起飽和。為此我們列出了三種最常見的雙鏈情景：
雙重反應情景① 在這個最常見的情景中，所有樣本中豐度更高的基因或基因產(chǎn)物均相同。僅豐度更高的靶點分析需要引物限制。例如，標準品可能是 18S 核糖體 RNA，其占真核細胞總RNA 的 20%。每個樣本中 18S rRNA cDNA 的豐度高于任意mRNA cDNA。因此僅 18S 分析需要引物限制。
雙重反應情景② 在本情景中，兩個基因在所有樣本中的豐度幾乎相同。一般而言，兩種基因的 Ct 差異為 3 或者更高，假定閾值相同，則認為兩個基因的豐度不同?；蚪M DNA 應用領(lǐng)域 (如拷貝數(shù)差異) 最可能出現(xiàn)此情景。情景 2 無需引物限制，因為兩種基因幾乎同時經(jīng)歷幾何擴增期。
雙重反應情景③ 在本情景中，基因或基因產(chǎn)物的豐度明顯高于其它。此時，兩種分析均應為引物限制。 多重反應引物相互作用 影響多重分析性能的另一個潛在威脅是不同分析的引物間不必要的相互作用。引物相互作用的風險會隨反應中分析數(shù)目的增加而提高，因為隨著多重反應分析數(shù)的增加，出現(xiàn)的引物對的數(shù)目會隨之大幅增加。例如，在包含4個PCR 引物的雙重反應分析中，可能有6種不同的PCR引物對，在包含6個PCR引物的三重分析中，則可能有 15 種不同的PCR引物對。在單重反應中，每個分析可能都運行得很好，但在多重反應中，引物的相互作用可形成競爭產(chǎn)物，抑制擴增的進行。當多重反應分析具有同源性時，引物相互作用的幾率會提高。如果基于單重反應與多重反應的 Ct 值存在明顯差異的觀察得出存在引物的相互作用的現(xiàn)象，則補救措施是對之前的多重反應的實驗采用不同的 Assay 進行。
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