最近有朋友在公眾號(hào)后臺(tái)留言如何評(píng)估內(nèi)含子突變對(duì)基因的影響，今天又有一位朋友詢問(wèn)剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)的軟件有哪些？雖然從表面上看這是兩個(gè)問(wèn)題，但是在我看來(lái)內(nèi)含子突變對(duì)基因的影響主要體現(xiàn)在改變外顯子剪切上，所以可以看作一個(gè)問(wèn)題：如何評(píng)估點(diǎn)突變對(duì)外顯子剪切的影響。

    從DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄出的最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中除去內(nèi)含子，并將外顯子連接起來(lái)形成一個(gè)連續(xù)的RNA分子的過(guò)程叫做RNA剪接。

ESE, exonic splicing enhancer; ESS, exonic splicing silencer; ISE, intronic splicing enhancer; ISS, intronic splicing silencer; ss, splice site

相關(guān)動(dòng)畫如下：

    真核細(xì)胞pre-mRNA的剪接位點(diǎn)處存在一定的序列保守性，對(duì)于它所對(duì)應(yīng)的cDNA序列而言，內(nèi)含子5’端（供體位點(diǎn)）和3’端（受體位點(diǎn)）的堿基幾乎都是GT和AG，因此稱為GT-AG規(guī)則。如果在外顯子內(nèi)含子交界處發(fā)生突變（較多見）或內(nèi)含子內(nèi)部（少見）突變改變外顯子剪切方式或多出一段外顯子，將直接導(dǎo)致基因的功能改變，這樣的突變也稱為L(zhǎng)OF突變（loss of function）。

游俠將以幾個(gè)知名的案例來(lái)講解幾個(gè)軟件的評(píng)估效果。

     中日友好醫(yī)院顧大夫新浪微博記載《基因檢測(cè)結(jié)果解讀——從一個(gè)家庭的困惑說(shuō)起》，8歲男孩，1歲6個(gè)月步態(tài)不穩(wěn)，2歲后吐字不清， 7歲后行走能力下降，小腦萎縮。經(jīng)三家基因檢測(cè)公司最后確診為PLA2G6基因上的兩個(gè)突變引起，其中一個(gè)為剪切位點(diǎn)突變c.1077G＞A。（基因組位置chr22:38528838C>T，hg19）

    一對(duì)來(lái)自河北衡水農(nóng)村的貧困姐弟倆，先天失聰、失語(yǔ)，且存在嚴(yán)重視力障礙--視網(wǎng)膜色素變性。姐弟均雙耳全聾、視力進(jìn)行性減退、夜盲、紅綠色盲、視野縮小、雙眼眼球震顫，經(jīng)過(guò)藥明康德明碼生物基因檢測(cè)確診為MYO7A突變引起的Usher綜合征，其中一個(gè)突變位點(diǎn)為剪切位點(diǎn)c.849+2T>C（基因組位置chr11:76868440T>C，hg19 ）

    654β地中海貧血，, HBB基因第二內(nèi)含子654 突變是最常見的導(dǎo)致 β地中海貧血發(fā)生的突變類型之一 。該突變?cè)?β 珠蛋白基因第二內(nèi)含子第 654 位發(fā)生 C >T突變（NM_000518.4:c.316-197C>T, rs34451549，基因組位置chr11: 5247153G>A），形成一個(gè)新的 5' 供體剪接位點(diǎn), 同時(shí)又激活了IVS Ⅱ第 597 位一個(gè)潛在的 3' 受體剪接位點(diǎn), 導(dǎo)致IVS Ⅱ中這兩個(gè)新的剪接位點(diǎn)之間一段長(zhǎng) 73 bp 的序列被作為額外的外顯子插入到外顯子 2 和 3 之間，產(chǎn)生一種異常的 mRNA，從而引起β地貧表型。

     第一個(gè)評(píng)測(cè)軟件為scSNV，相關(guān)文獻(xiàn)如下（pmid：25416802），該軟件主要使用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法對(duì)之前已報(bào)導(dǎo)的剪切位點(diǎn)突變進(jìn)行訓(xùn)練識(shí)別，從而可以對(duì)新的剪切位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估。

通過(guò)Annovar軟件結(jié)合scSNV數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)以上案例一與案例二兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估，第三個(gè)案例距離剪切位點(diǎn)邊界太遠(yuǎn)，scSNV只評(píng)估：?3 to +8 at the 5`splice site 和?12 to +2 at the 3`splice site區(qū)域內(nèi)突變。

結(jié)果如下

數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用兩種算法AdaBoost與random forests，任一種得分大于0.6即認(rèn)為改變剪切，數(shù)值越大越有可能改變剪切，從結(jié)果來(lái)看，svSNV預(yù)測(cè)的非常準(zhǔn)。

    第二個(gè)軟件為HSF 3.0，網(wǎng)址為http:///HSF3/，該算法主要是應(yīng)用各種剪切相關(guān)蛋白的識(shí)別的序列motif進(jìn)行識(shí)別，不但可以識(shí)別潛在的剪切位點(diǎn)還可以識(shí)別branch point突變。具體算法介紹參見pmid：19339519。

首先我們需要用UCSC view DNA工具提取三個(gè)位點(diǎn)附近各50bp序列。

PLA2G6 >hg19_dna range=chr22:38528788-38528888 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

TGCATTCCCACCGGGGCCCCACAGGGCAGGACACGCGGTCCTGGGCTCAC

CGACATGGCCAGGTGCAGCGGGGTGTTGCCGTGCTCTCCGCGGGCATCCG

C

HSF預(yù)測(cè)結(jié)果如下：

MYO7A>hg19_dna range=chr11:76868390-76868490 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none
GAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGG
TGAGGCCCAGGTGGGCCCCTGGGTAGGGGGGCACCCACCCTAGGATTGTA
G

HSF預(yù)測(cè)結(jié)果如下：

HBB >hg19_dna range=chr11:5247103-5247203 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none
TCAGTTACAATTTATATGCAGAAATATTTATATGCAGAGATATTGCTATT
GCCTTAACCCAGAAATTATCACTGTTATTCTTTAGAATGGTGCAAAGAGG
C
HSF預(yù)測(cè)結(jié)果如下：

從分析結(jié)果來(lái)看，HSF分析的準(zhǔn)確度并不高，三個(gè)位點(diǎn)只有一個(gè)位點(diǎn)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

    第三個(gè)軟件為SPIDEX，由基因組學(xué)深度學(xué)習(xí)知名機(jī)構(gòu)Deep Genomics出品，該算法使用最新的深度學(xué)習(xí)的方法對(duì)已有的資料進(jìn)行訓(xùn)練，可以對(duì)剪切位點(diǎn)附近300bp以內(nèi)的位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別預(yù)測(cè)，相關(guān)文獻(xiàn)參見pmid：25525159。

該軟件為商業(yè)化軟件，企業(yè)需要付費(fèi)購(gòu)買，有一個(gè)免費(fèi)的網(wǎng)頁(yè)可以查詢http://tools.genes./。

以上為初步的位點(diǎn)比對(duì)，SPIDEX不能識(shí)別HBB內(nèi)含子突變。對(duì)于其他兩個(gè)位點(diǎn)，預(yù)測(cè)結(jié)果如下

根據(jù)文獻(xiàn)建議當(dāng)dPSI_percentile小于3時(shí)可認(rèn)為引起可變剪切，從結(jié)果來(lái)看案例一預(yù)測(cè)數(shù)值為1.3預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，案例二預(yù)測(cè)數(shù)值為0.07預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

       雖然只是測(cè)試了三例，評(píng)估不是非?？陀^，但是管中窺豹，從以上的結(jié)果中我們可以看到對(duì)于剪切位點(diǎn)附近的突變，scSNV與SPIDEX預(yù)測(cè)最好，游俠還是推薦scSNV，因?yàn)閟cSNV已有免費(fèi)全基因組范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合annovar軟件非常方便，當(dāng)然為了確保結(jié)果最好還是用SPIDEX相互驗(yàn)證一下為好。對(duì)于內(nèi)含子內(nèi)部的位點(diǎn)，目前軟件很難預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，當(dāng)懷疑為內(nèi)含子突變引起的可變剪切時(shí)，也許做一個(gè)RNA逆轉(zhuǎn)錄是比較實(shí)際的方法。特別提示，在本測(cè)試案例一中，突變位點(diǎn)為同義突變，在臨床工作中很容易遺漏，為了避免這類情況，HGMD專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)與可變剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)非常有必要。