③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。

④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。

⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。

⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。

⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；后者無此缺點。

⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。

2）氧化鋁

具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩(wěn)定。不過現在已經出現了在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。

3）聚合物

以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩(wěn)定，可以用NaOH或強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。

所有聚合物基質在流動相發(fā)生變化時都會出現膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。

2．基質的選擇

硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。

注：+++好  ++一般  +差

二、化學鍵合固定相

將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。

1．鍵合相的性質

目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm²，由于空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。

殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是堿性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的“濕潤”性能。

由于不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。

pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。

2．鍵合相的種類

化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH₂)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。

常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。

另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。

3．固定相的選擇

分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發(fā)生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。

另外，美國藥典對色譜法規(guī)定較嚴，它規(guī)定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現；而中國藥典僅規(guī)定填料種類，未規(guī)定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。

三、流動相

1．流動相的性質要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：

①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。

③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

④粘度要低（應<>）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

⑥樣品易于回收。應選用揮發(fā)性溶劑。

2．流動相的選擇

在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。

正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統(tǒng)做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術。

參考資料：

乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價格是甲醇的6~7倍。

反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：

C_乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C_甲醇

C_四氫呋喃＝0.66C_甲醇

C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。

3．流動相的pH值

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

4．流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。

除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。

離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。

在線（系統(tǒng)內）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。

一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

5．流動相的濾過

所有溶劑使用前都必須經0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。

用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機相濾膜?，F在已有混合型濾膜出售。

6．流動相的貯存

流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。

7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題

鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl₄、CHCl₃等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH₂Cl₂）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶?？傊?，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。

8．HPLC用水

HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。

進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量?？傆袡C碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO₂，測游離的CO₂）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。

I類水標準：

美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標準蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 μS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發(fā)物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。

V．HPLC應用

一、樣品測定

1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。

2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。

3．記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。

4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）

5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。

6．儀器的使用：

①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。

②柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。

③安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。

④樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發(fā)性。

⑤測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗過夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。

⑥沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統(tǒng)，則應更換水）。

二、方法研究

1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。

2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。

附件：高效液相色譜法（HPLC）復核細則

一、對起草單位的要求：

1．HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據及參考文獻。

2．應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。

3．建立方法時，應考慮下列事項：

①首選填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比較試驗，其中一根為國產柱。

②流動相首選甲醇-水系統(tǒng)，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為7~8；如為酸性藥物，流動相的pH值應為3~4。

③盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。

④內標物應首選易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。

⑤檢測器首選UV檢測器。

4．采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應首選自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。

5．HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5％）。

二、對復核單位的要求：

1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。

2．當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行最低撿出量試驗。

3．應考慮對同一樣品分析結果的重現程度、方法的可行性，并作出評價。(下