一、液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況
色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。
二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)
HPLC有以下特點(diǎn)：
高壓——壓力可達(dá)150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
高效——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。
HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：
速度快——通常分析一個(gè)樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。
柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法　使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
2．液液色譜法　使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法　采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法　一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
 正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動(dòng)相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出
從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法　固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對(duì)色譜法　又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。
分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對(duì)色譜法常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。
5．排阻色譜法　固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

一、基本概念和術(shù)語
1．色譜圖和峰參數(shù)
色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。
基線(base line)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。
噪音(noise)——基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂移。
色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。
拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetry factor)或不對(duì)稱因子(asymmetry factor)。《中國藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
峰底——基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。
峰高(peak height，h)——峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。
峰寬(peak width，W)——峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W＝4σ
半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，σ)——正態(tài)分布曲線x＝±1時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數(shù)（保留值）
死時(shí)間(dead time，t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測(cè)定死時(shí)間。
死體積(dead volume，V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
保留時(shí)間(retention time，tR)——從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。
保留體積(retention volume，VR)——從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR
調(diào)整保留時(shí)間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱折合保留時(shí)間(reduced retention time)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數(shù)
理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對(duì)稱并符合正態(tài)分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時(shí)，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。
N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。
理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長(zhǎng)的方差。H＝。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數(shù)
分配系數(shù)(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。K＝。
分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)?。ɑ蚍Q交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。
在條件（流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時(shí)（Cs、Cm很小）時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。
容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。
分配系數(shù)、容量因子與保留時(shí)間之間有如下關(guān)系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（t'R）是不保留組分保留時(shí)間（t0）的幾倍。k＝0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)。
容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。
選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α＝＝  （設(shè)k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對(duì)保留時(shí)間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數(shù)
分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當(dāng)W1＝W2時(shí)，R＝。當(dāng)R＝1時(shí)，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R＝1.5時(shí)，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離?！吨袊幍洹芬?guī)定R應(yīng)大于1.5。
基本分離方程——分離度與三個(gè)色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系：
R＝××
其中稱為柱效項(xiàng)，為柱選擇性項(xiàng)，為柱容量項(xiàng)。柱效項(xiàng)與色譜過程動(dòng)力學(xué)特性有關(guān)，后兩項(xiàng)與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān)。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α＝1時(shí)，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設(shè)
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為：
1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。
2） 樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。
3） 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。
雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符，如色譜過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h(yuǎn)和峰面積A）
根據(jù)塔板理論，流出曲線可用下述正態(tài)分布方程來描述：
C＝e　　或　　C＝e
由色譜流出曲線方程可知：當(dāng)t＝tR時(shí)，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)（即σ一定），峰高h(yuǎn)與組分的量C0（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，σ越?。ㄖг礁撸?，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對(duì)V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0?？梢夾相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計(jì)算公式。
三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學(xué)者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。它把色譜過程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過程，研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴(kuò)散（eddy diffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會(huì)使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小?？偟恼f來，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料，A＝0。
2）分子擴(kuò)散（molecular diffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u＝2γDm/u。u為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長(zhǎng)（u小），展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm進(jìn)行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細(xì)管柱的γ＝1。
3）傳質(zhì)阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。
①流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致?？拷畛漕w粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。
②靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對(duì)峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質(zhì)阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí)Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進(jìn)樣時(shí)間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ訦對(duì)u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時(shí)，H最小。一般在液相色譜中，uopt很?。ù蠹s0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測(cè)器死體積。
3．柱外效應(yīng)
速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內(nèi)＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對(duì)接宜呈流線形，檢測(cè)器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)＜VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體積≤VR/2。
柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對(duì)較小。

HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。
最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長(zhǎng)的檢測(cè)器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測(cè)量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測(cè)器從單波長(zhǎng)至可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測(cè)器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測(cè)器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡(jiǎn)單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。
目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
一、輸液泵
1．泵的構(gòu)造和性能
輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300 kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。
泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。
柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400 kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。
2．泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：
①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。
②流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇－水）。
③泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。
④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。
⑤流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。
如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：
①?zèng)]有流動(dòng)相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時(shí)可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。
②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時(shí)，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。
③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行。
3．梯度洗脫
HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。
梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。
在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：
①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。
④每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。
二、進(jìn)樣器
早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。
1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2．停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3．閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。
六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。
六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
4．自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。
三、色譜柱
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析，只要500即可；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長(zhǎng)就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。
柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。
1．柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長(zhǎng)10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1~2mm，柱長(zhǎng)10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長(zhǎng)10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。
2．柱的發(fā)展方向
因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng)3~10cm，填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。
3．柱的填充和性能評(píng)價(jià)
色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度＞20μm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20μm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。
必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。
一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對(duì)稱度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。
①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。
②　應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?br>③　一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
④　選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
⑤　避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
⑥　經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200μl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦　保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
⑧　色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。
每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘。
四、檢測(cè)器
檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。
1．分類
1）按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測(cè)器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)器。
2）按測(cè)量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。
3）按檢測(cè)方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。
4）檢測(cè)器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標(biāo)
1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測(cè)器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測(cè)器，那么它們還反映流速（泵的脈動(dòng)）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。
2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測(cè)器時(shí)所給出的信號(hào)大小。對(duì)濃度型檢測(cè)器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV?ml/g。對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV?s/g。
3）檢測(cè)限(detection limit)
檢測(cè)器靈敏度的高低，并不等于它檢測(cè)最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí)，沒有考慮噪聲的大小，而檢測(cè)限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。
檢測(cè)限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分的量（對(duì)濃度型檢測(cè)器指在流動(dòng)相中的濃度——注意與分析方法檢測(cè)限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測(cè)器中來測(cè)定其檢測(cè)限的大小。
檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測(cè)器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測(cè)限除了與檢測(cè)器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。
4）線性范圍(linear range)：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。也可用響應(yīng)信號(hào)的最大與最小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測(cè)器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號(hào)與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。但實(shí)際上沒有一臺(tái)檢測(cè)器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A＝BCx，B為響應(yīng)因子，當(dāng)x=1時(shí)，為線性響應(yīng)。對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器來說，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1，實(shí)際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測(cè)器的線性范圍盡可能大些，能同時(shí)測(cè)定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測(cè)等。
5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10μl。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到1~2μl甚至更低，不然檢測(cè)系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問題就會(huì)很嚴(yán)重。而且這時(shí)池體、檢測(cè)器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector)
UV檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍包括可見光時(shí)，又稱為紫外-可見檢測(cè)器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測(cè)器進(jìn)行微量分析。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長(zhǎng)。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會(huì)提高背景噪音，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測(cè)限）。此外，梯度洗脫時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長(zhǎng)，溶劑的吸光度A＝1時(shí)的波長(zhǎng)稱為溶劑的截止波長(zhǎng)。也稱極限波長(zhǎng)。
中國藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得過0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。
UV檢測(cè)器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長(zhǎng)度L成正比：
A＝lg＝lg＝ECL
式中I0為入射光強(qiáng)度，I為透射光強(qiáng)度，T為透光率，E為吸收系數(shù)。
UV檢測(cè)器分為固定波長(zhǎng)檢測(cè)器、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系統(tǒng)來分，UV檢測(cè)器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長(zhǎng)檢測(cè)器又可分單波長(zhǎng)（單通道）檢測(cè)器和雙波長(zhǎng)（雙通道）檢測(cè)器。PDAD是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測(cè)器，它可以對(duì)每個(gè)洗脫組分進(jìn)行光譜掃描，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜用于定量。常用于復(fù)雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測(cè)器有關(guān)的故障及其排除
1）流動(dòng)池內(nèi)有氣泡
如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀“峰”，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動(dòng)池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動(dòng)池破裂。
2）流動(dòng)池被污染
無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移。可以使用適當(dāng)溶劑清洗檢測(cè)池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。
3）光源燈出現(xiàn)故障
紫外或熒光檢測(cè)器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。
4）倒峰
倒峰的出現(xiàn)可能是檢測(cè)器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測(cè)器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動(dòng)相。如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測(cè)器時(shí)，無吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的。
五、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測(cè)信號(hào)，再手工測(cè)量計(jì)算。其后，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù)。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①采集、處理和分析數(shù)據(jù)；②控制儀器；③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測(cè)器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測(cè)器的恒溫要求則更高。
溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對(duì)分離選擇性影響不大；還可使流動(dòng)相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對(duì)分離的影響并不顯著，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對(duì)保留值的影響很大。
不同的檢測(cè)器對(duì)溫度的敏感度不一樣。紫外檢測(cè)器一般在溫度波動(dòng)超過±0.5℃時(shí)，就會(huì)造成基線漂移起伏。示差折光檢測(cè)器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測(cè)器也要求在±0.001℃以內(nèi)。

在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu)化的任務(wù)之一。本章著重討論填料基質(zhì)、化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及其選擇。
一、基質(zhì)（擔(dān)體）
HPLC填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機(jī)物基質(zhì)，也可以是有機(jī)聚合物基質(zhì)。無機(jī)物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無機(jī)物基質(zhì)剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機(jī)聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機(jī)聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機(jī)基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，結(jié)果減少傳質(zhì)，最終使柱效降低。
1．基質(zhì)的種類
1）硅膠
硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強(qiáng)度外，還提供一個(gè)表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點(diǎn)是在堿性水溶性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為2~8。
硅膠的主要性能參數(shù)有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強(qiáng)，對(duì)溶質(zhì)的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透性差；后者無此缺點(diǎn)。
⑧硅膠純度。對(duì)稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長(zhǎng)，堿性成份不拖尾。
2）氧化鋁
具有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會(huì)在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。不過現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。
3）聚合物
以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機(jī)填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強(qiáng)，但它可以通過適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬兂捎H水性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復(fù)沖洗。
所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。
2．基質(zhì)的選擇
硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
 二、化學(xué)鍵合固定相
將有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相。這類固定相的突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來改變分離的選擇性。
1．鍵合相的性質(zhì)
目前，化學(xué)鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應(yīng)，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個(gè)/nm2，由于空間位阻效應(yīng)（不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應(yīng)。
殘余的硅醇基對(duì)鍵合相的性能有很大影響，特別是對(duì)非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對(duì)極性溶質(zhì)（特別是堿性化合物）產(chǎn)生次級(jí)化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化（使溶質(zhì)在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進(jìn)行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動(dòng)相有更好的“濕潤(rùn)”性能。
由于不同生產(chǎn)廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應(yīng)條件不同，因此具有相同鍵合基團(tuán)的鍵合相，其表面有機(jī)官能團(tuán)的鍵合量往往差別很大，使其產(chǎn)品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。
pH值對(duì)以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應(yīng)在pH=2~8的介質(zhì)中使用。
2．鍵合相的種類
化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。
常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團(tuán)與溶質(zhì)分子間的氫鍵作用，極性強(qiáng)的組分保留值較大。極性鍵合相有時(shí)也可作反相色譜的固定相。
常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長(zhǎng)對(duì)樣品容量、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長(zhǎng)增加而增大，且長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，并常?？筛纳品蛛x的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時(shí)可得到對(duì)稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似。
另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長(zhǎng)的烷基鏈保護(hù)了硅膠基質(zhì)的緣故，但C18基團(tuán)空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時(shí)柱效較低。
3．固定相的選擇
分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對(duì)雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對(duì)某些多官能團(tuán)化合物如甾體、強(qiáng)心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因?yàn)樗鼈冎g會(huì)發(fā)生反應(yīng)生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。
分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術(shù)，例如反相離子抑制技術(shù)和反相離子對(duì)色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應(yīng)用最為廣泛的非極性鍵合相，它對(duì)各種類型的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。
另外，美國藥典對(duì)色譜法規(guī)定較嚴(yán)，它規(guī)定了柱的長(zhǎng)度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細(xì)，這樣使色譜圖易于重現(xiàn)；而中國藥典僅規(guī)定填料種類，未規(guī)定柱的長(zhǎng)度和粒度，這使檢驗(yàn)人員難于重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)，在某些情況下還浪費(fèi)時(shí)間和試劑。
三、流動(dòng)相
1．流動(dòng)相的性質(zhì)要求
一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。
選好填料（固定相）后，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面吸附增加，相應(yīng)的容量因子k升高。因此，k值是流動(dòng)相組成的函數(shù)。塔板數(shù)N一般與流動(dòng)相的粘度成反比。所以選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：
①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
③必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
2．流動(dòng)相的選擇
在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；在反相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。
正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。
反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動(dòng)相粘度小、價(jià)格低，是反相色譜最常用的流動(dòng)相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統(tǒng)做初始實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榕c甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測(cè)的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。
在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。
參考資料：
乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價(jià)格是甲醇的6~7倍。
反相色譜中，如果要在相同的時(shí)間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時(shí)其沖洗強(qiáng)度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度配比有如下關(guān)系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇
C為不同有機(jī)溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強(qiáng)度相當(dāng)于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度。
3．流動(dòng)相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
4．流動(dòng)相的脫氣
HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。
除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。
離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)。
一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動(dòng)相的濾過
所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過”）。
用濾膜過濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機(jī)相濾膜?，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。
6．流動(dòng)相的貯存
流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。
7．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題
鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶?？傊?，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問題。
8．HPLC用水
HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測(cè)器基線的校正和反相柱的洗脫。
進(jìn)行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時(shí)，沒有有機(jī)物污染是非常重要的。測(cè)高錳酸鉀顏色保留時(shí)間的定性方法反應(yīng)慢，對(duì)很低水平的有機(jī)物（對(duì)HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量?？傆袡C(jī)碳(TOC)分析儀（把有機(jī)物氧化成CO2，測(cè)游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機(jī)物的測(cè)定。
I類水標(biāo)準(zhǔn)：
 NCCLS ASTM
電阻率，MΩ?cm，25℃，最小 10.0 18.0
硅酸鹽，mg/L，最大 0.05 0.003
微粒，μm濾器 0.22 0.2
微生物，CFU/ml 10 分三檔
美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標(biāo)準(zhǔn)蔗糖溶液1.19 mg/L），電導(dǎo)率在室溫pH 6時(shí)≤2.4 μS/cm（即≥0.42 MΩ?cm）。HPLC級(jí)水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發(fā)物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。

一、樣品測(cè)定
1．流動(dòng)相比例調(diào)整：由于我國藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒有規(guī)定柱的長(zhǎng)度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時(shí)幾乎都須調(diào)整流動(dòng)相（按經(jīng)驗(yàn)，主峰一般應(yīng)調(diào)至保留時(shí)間為6~15分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請(qǐng)注意充分平衡柱。
2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。
3．記錄時(shí)間：第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長(zhǎng)時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。
4．進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10ml，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ml、20ml和50ml），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度）
5．計(jì)算：由于有些對(duì)照品標(biāo)示含量的方式與樣品標(biāo)示量不同，有些是復(fù)合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標(biāo)示，檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)注意。
6．儀器的使用：
①流動(dòng)相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請(qǐng)重新濾過。
②柱在線時(shí)，增加流速應(yīng)以0.1ml/min的增量逐步進(jìn)行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會(huì)使柱床下塌，叉峰。柱不線時(shí)，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。
③安裝柱時(shí)，請(qǐng)注意流向，接口處不要留有空隙。
④樣品液請(qǐng)注意濾過（注射液可不需濾過）后進(jìn)樣，注意樣品溶劑的揮發(fā)性。
⑤測(cè)定完畢請(qǐng)用水沖柱1小時(shí)，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗過夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對(duì)于含碳量高、封尾充分的柱，應(yīng)先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。
⑥沖水的同時(shí)請(qǐng)用水充分沖洗柱頭（如有自動(dòng)清洗裝置系統(tǒng)，則應(yīng)更換水）。
二、方法研究
1．波長(zhǎng)選擇：首先在可見紫外分光光度計(jì)上測(cè)量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)，如最靈敏的測(cè)量波長(zhǎng)并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸收度小于0.5時(shí)，HPLC測(cè)定的面積將會(huì)很小。
2．流動(dòng)相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動(dòng)相。

附件：高效液相色譜法（HPLC）復(fù)核細(xì)則
一、對(duì)起草單位的要求：
1．HPLC法用于藥品的有關(guān)物質(zhì)檢查或含量測(cè)定時(shí)，需提供建立HPLC法的依據(jù)及參考文獻(xiàn)。
2．應(yīng)對(duì)建立的方法進(jìn)行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證項(xiàng)下所列的要求進(jìn)行試驗(yàn)。
3．建立方法時(shí)，應(yīng)考慮下列事項(xiàng)：
①首選填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對(duì)兩根不同品牌的色譜柱進(jìn)行比較試驗(yàn)，其中一根為國產(chǎn)柱。
②流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，如為堿性藥物，流動(dòng)相的pH值應(yīng)為7~8；如為酸性藥物，流動(dòng)相的pH值應(yīng)為3~4。
③盡可能選用流動(dòng)相作為溶劑，如未能選用，應(yīng)說明原因。
④內(nèi)標(biāo)物應(yīng)首選易得到的純度較高的化學(xué)試劑或?qū)φ掌?，?yīng)與待測(cè)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，理化性質(zhì)接近，峰的響應(yīng)值相當(dāng)，以及分離度應(yīng)大于1.5，另應(yīng)考慮對(duì)照品的來源問題。
⑤檢測(cè)器首選UV檢測(cè)器。
4．采用HPLC法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)，如雜質(zhì)峰的響應(yīng)值與主成分峰的響應(yīng)值相差太大，應(yīng)首選自身對(duì)照法，而不宜選用面積歸一化法。
5．HPLC法用于原料藥的含量測(cè)定。如以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，應(yīng)考慮內(nèi)標(biāo)物是否含有干擾供試品的雜質(zhì)；如以外標(biāo)法測(cè)定含量，對(duì)照品與供試品應(yīng)各取樣2份，對(duì)照晶溶液各進(jìn)樣3次，供試品溶液各進(jìn)樣2次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD應(yīng)不得大于l.5％）。
二、對(duì)復(fù)核單位的要求：
1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進(jìn)行復(fù)核。
2．當(dāng)HPLC法用于有關(guān)物質(zhì)的檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行最低撿出量試驗(yàn)。
3．應(yīng)考慮對(duì)同一樣品分析結(jié)果的重現(xiàn)程度、方法的可行性，并作出評(píng)價(jià)。