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生物素標記抗體 生物素標記反應(yīng)簡單、溫和且很少抑制抗體活性，生物素標記的抗體可存放多年而不失活。能與生物素結(jié)合的二級試劑為親和素和鏈霉親和素，所需的各種標記物均可購置。此外，親和素和鏈霉親和素的結(jié)合背景水平非常低．結(jié)合緊密且快速。故可消除多步驟程序中的許多缺點。生物素拯記—尥王要優(yōu)點是標記一抗后，再選用親和素或鏈霉親和素標記的二級試劑進行測定。 抗體很容易與經(jīng)過化學修飾的活化生物素結(jié)合。生物素又可以與結(jié)合有酶、熒光染料或放射性碘的親和素或鏈霉親和素連接，后者已有商品試劑供應(yīng)。這樣只需將純化抗體與生物素結(jié)合，就可用各種不同的標記物來檢測。鏈霉親和素及親和素與生物素的親和力非常高(Ka1015L／mo1)，并且二者間的相互作用實質(zhì)上是不可逆的。由于鏈霉親和素的等電點（pI）更適宜故其更常用，背量也因此較低。 將生物素與抗體共價結(jié)合是一種非常簡便和直接的標記方法。通常，生物素對抗體并無負面影響且標記條件溫和，用親和素或鏈霉親和素標記試劑進行檢測的敏感性與使用標記抗IZ抗體相同。Becker和Wichek(1972)、Heitzmann和Richards(1974)及Heggeness和Ash(1977)等提供了首次使用生物素與親和素復(fù)合物的例證，而且Green(1963，1990)對兩者的相互作用做了詳細論述。 大多數(shù)生物素?；磻?yīng)是利用生物素的N—羥基琥珀酰亞胺酯。琥珀酰亞胺基可以與抗體上的自由氨基結(jié)合，通常是賴氨酰側(cè)鏈?，F(xiàn)在許多生物素?；ゾ少彽?。此類變構(gòu)物改變了生物素的分子大小及其與偶合基團之間空間橋聯(lián)臂的特性等。某些情況下，空間橋聯(lián)臂起決定性作用。例如，較長的空間橋聯(lián)臂可以使偶聯(lián)物更容易接近生物素，其柔韌性也更好，盡管也更容易出現(xiàn)非特異結(jié)合。某些空間橋聯(lián)臂可以劈開，這樣就可在一定的控制條件下將抗體釋放出來。表4．6列出許多可以利用的空間橋聯(lián)臂及其特性。所有這些酯類均可用下列方法處理。如果沒有其他特殊要求，一般推薦使用生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯。 可利用的空間橋聯(lián)臂及其特性
1．準備工作 在進行標記之前需要獲得經(jīng)過純化的抗體。如下所述，應(yīng)在抗體中加入硼酸鹽緩沖液并調(diào)整pH值至8．8，應(yīng)避免引入任何帶有一級胺的外來分子。開始標記前，應(yīng)先計算生物素酯分子與抗體分子的比率，在大多數(shù)情況下，推薦兩者的比率約為4：1。 2．所需溶液與化合物 PBSlmol／L氯化銨、10％疊氮鈉和所需的生物素酯等。 3．操作步驟 (1)用無水DMSO配制10mg／ml生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液。 (2)用硼酸鹽緩沖液(0．1mol／L，pH8．8)配制濃度至少為1—3mg／ml的抗體溶液，若抗體儲存時加入了疊氮鈉，則標記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。 (3)按25～100t~g／mg的比率將生物素酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4ho在完成結(jié)合反應(yīng)之前DMSO的終濃度不能低于5％，否則生物素酯會出現(xiàn)沉淀。高濃度的生物素酯會導(dǎo)致多個生物素分子結(jié)合在抗體上，因此可能會使所有抗體都被標記。較低的比率則會是使生物素化保持在最低限度(25gg生物素酯／mg抗體的最初摩爾比為10：1 應(yīng)用不同的酯／抗體摩爾比(3：1，10：1，30：1)的多反應(yīng)體系，可以通過側(cè)鏈不同水平地連接到抗體分子上(所試驗的側(cè)鏈上)。 (4)每250／ (5)將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。由于生物素分子較大，故透析比預(yù)料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。 (6)按純化抗體的儲存方法保存標記抗體。 4．常見問題 與生物素結(jié)合后，抗體的活性可能會降低。這種情況常發(fā)生在保持抗體活性所必需的游離氨基基團或抗原結(jié)合位點和生物素過多的結(jié)合，此時，生物素化會降低或破壞蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合能力，可以通過實驗室中常用的試驗來比較相同滴度的結(jié)合抗體與純化抗體的活性，以確定結(jié)合抗體的活性是否改變。
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