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專利名稱培養(yǎng)微生物的方法 技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)適合于產(chǎn)生作為細菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇的微生物。 技術(shù)背景根據(jù)細菌種類和環(huán)境條件，細菌代謝可通過各種不同機制發(fā)生。 異養(yǎng)菌(包括所有的病原體)通過氧化有機化合物獲得能量，碳水化 合物(特別是葡萄糖)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)是最常見的被氧化的化合物。利 用細菌對這些有機化合物進行的生物氧化最終會合成作為化學能來源的ATP。該過程也會生成細菌細胞進行生物合成反應(yīng)所需的更加筒單 的有機化合物(前體分子)。細菌代謝適合底物的一般過程是糖酵解， 糖酵解是一系列將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸同時生成ATP的反應(yīng)。生成代 謝能的過程中丙酮酸的去向會根據(jù)微生物和環(huán)境條件而變化。主要的 丙酮酸反應(yīng)有三種。第一，在需氧條件下，許多微生物會在丙酮酸脫氫酶(PDH)的 催化下利用檸檬酸循環(huán)和將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A來產(chǎn)生能量。第二，在厭氧條件下，某些產(chǎn)乙醇生物可通過在丙酮酸脫羧酶 (PDC )的催化下將丙酮酸脫羧成為乙醛，并且隨后在醇脫氫酶 (ADH)的催化下利用NADH將乙醛還原為乙醇來進行乙醇發(fā)酵。第三個過程是通過乳酸脫氫酶(LDH)催化，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。人們對使用微生物一一使用天然進行厭氧發(fā)酵的微生物或使用引 入了乙醇生產(chǎn)中所涉及基因的重組微生物——來生產(chǎn)乙醇很感興趣。 盡管在利用這些微生物生產(chǎn)乙醇方面獲得了一定的成功，但是通常乙 醇濃度增加會使發(fā)酵受損，特別是當微生物的乙醇耐受性水平較低時。已經(jīng)有人提出使用嗜熱細菌進行乙醇生產(chǎn)，使用嗜熱細菌的優(yōu)勢 在于可以在較高溫度下進行發(fā)酵，這使得可以在50。C以上的溫度下將 所產(chǎn)生的乙醇以蒸氣的形式移出；這也使得可以利用高糖濃度進行發(fā)酵。然而，問題在于能否找到可以有效生產(chǎn)乙醇的合適嗜熱細菌。WO01/49865公開了 一種被轉(zhuǎn)化了編碼丙酮酸脫羧酶的異源基因、 并且具有天然的醇脫氫酶功能的革蘭氏陽性細菌用于乙醇生產(chǎn)。所述 細菌為嗜熱性的桿菌(5fl'7/w)，可通過插入轉(zhuǎn)座子使乳酸脫氫酶基 因失活來對該細菌進4亍<務(wù)飾。WO01/49865中/^開的細菌全部來源于 桿菌屬菌林LLD-R,它是一種自發(fā)地從培養(yǎng)物中長出的孢子形成缺陷 菌林，且在該菌林中l(wèi)dh基因已經(jīng)通過自發(fā)突變或化學誘變失活。所 公開的菌林LN和TN是LLD-R菌林的改良過的衍生菌林。然而，全 部的菌抹都含有Wm III型限制性系統(tǒng)，所述限制性系統(tǒng)妨礙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 并因此阻止非曱基化DNA中的轉(zhuǎn)化。WO01/85966公開了通過體內(nèi)曱基化以克服限制性問題而制備的 微生物。這需要將好^ III曱基轉(zhuǎn)移酶從埃及嗜血桿菌(好M附op/h7's fl^V/;''y)轉(zhuǎn)化到LLD-R、 LN和TN菌抹中。然而，LLD-R、 LN和 TN菌林是不穩(wěn)定的突變體并且會自發(fā)地回復為產(chǎn)乳酸的野生型菌林， 特別是在低pH和高糖濃度的環(huán)境中。這會導致發(fā)酵產(chǎn)物從乙醇變?yōu)?乳酸，使得所述菌林不適合用于乙醇生產(chǎn)。WO02/2卯30公開了 LLD-R菌林及其衍生菌林在ldh基因編碼區(qū) 包括一個天然存在的插入元件(IE)。將該插入元件轉(zhuǎn)入(和轉(zhuǎn)出)ldh 基因的轉(zhuǎn)座以及隨后的基因失活都是不穩(wěn)定的，從而導致回復。對此 給出的解決方案是將質(zhì)粒DNA整合到所述IE序列中。因此，在本領(lǐng)域中，用于乙醇生產(chǎn)的微生物的產(chǎn)生依賴于對實驗 室產(chǎn)生的化學誘變過的桿菌屬微生物進行修飾、用體內(nèi)曱基化方法處 理這些微生物和進一步修飾所述微生物以便將質(zhì)粒DNA整合到所述 IE序列中。該方法復雜并且不確定，且也存在如何使用所述菌林的管 理問題。因此需要改良過的用于乙醇生產(chǎn)的微生物。 發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一方面， 一種用于生產(chǎn)適合于乙醇生產(chǎn)的嗜熱微 生物的方法，包括(i)在需氧或厭氧條件下、在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜熱微生物；和(ii)將用量逐漸增加的乙醇摻入所述培養(yǎng)基以誘導乙醇耐受性。 具體實施方式 本發(fā)明是基于處理嗜熱微生物以使所述微生物對乙醇更加耐受， 并因此可以更好地生產(chǎn)乙醇。增加所述^L生物的乙醇耐受性使得所述 微生物可以在其發(fā)酵過程中對所產(chǎn)生的乙醇更加耐受。這使得可對發(fā) 酵進行改良。所述用于嗜熱微生物生產(chǎn)的方法包括在需氧或厭氧條件下、在適 合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜熱微生物并且將適量的乙醇摻入所述培養(yǎng)基以誘 導乙醇耐受性。在一個實施方案中，向所述培養(yǎng)基中增加乙醇是隨時 間并且通常以增量的方式進行的，以使得所述微生物可以適應(yīng)培養(yǎng)基 中增加的乙醇。優(yōu)選將乙醇摻入到最高達3% w/v的終濃度，然后將 乙醇濃度增加0.5% w/v或更少直至培養(yǎng)基中的乙醇濃度至少為6% w/v，更優(yōu)選至少7.5%。在一個實施方案中，初始的培養(yǎng)基含有3% w/v 的乙醇，然后將其以0.5%的增量增加到6% w/v，然后以0.25%的增 量增加到7.5% w/v。在該步驟中，可以監(jiān)測細胞密度以確保細胞持續(xù)生長。優(yōu)選地， 如果細胞密度(通過OD600 nm測定)下降超過25%并且隨乙醇濃度 增加而持續(xù)下降，則將乙醇濃度降低至上一個最高濃度，并且在繼續(xù) 用乙醇處理前恢復培養(yǎng)基。一種備選的用于具有較高乙醇耐受性的嗜熱微生物產(chǎn)生的方法包 括在需氧或厭氧條件下、在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述嗜熱微生物。一 旦培養(yǎng)物達到穩(wěn)態(tài)——此時，所述生物的生長已經(jīng)達到了恒定速率(通 過OD600 nm確定)——則向所述培養(yǎng)基中 一次加入適量的乙醇以使 乙醇達到一個特定的所需濃度，例如所述培養(yǎng)基設(shè)定工作體積的10% 或20。/。w/v。以低稀釋速率(優(yōu)選0.08-0.15 h')繼續(xù)該連續(xù)培養(yǎng)，使 得乙醇濃度緩慢降低直至所述嗜熱生物的最初生長速率得以恢復(通 過OD600 nm 測定)。此時，再向所述培養(yǎng)基中一次加入適量(與第一 次的加入量相同)的乙醇，以使得乙醇達到一個特定的所需濃度。重 復所述的使所述培養(yǎng)物恢復最初生長速率的過程，并且進一步分批加 入乙醇直至發(fā)現(xiàn)所述培養(yǎng)物迅速恢復，該過程花費不到24小時。此時會出現(xiàn)兩種結(jié)果之一。通過在所需的乙醇濃度(優(yōu)選高于7.5% w/v) 下傳代培養(yǎng)來從該培養(yǎng)物中篩選乙醇耐受菌林，或者將更大量的乙醇加入到所述培養(yǎng)物中并且重復加入乙醇之后生長速率恢復的過程。在55°C-65°CT，使所述微生物在含限碳底物的限定培養(yǎng)基中生長，pH為6.0-7.5 (優(yōu)選6.3-7.2)，稀釋速率為0.08-0.5。在分批培養(yǎng)中，可以實施一種類似于上文所述方法的方法，在含有過量碳的任何適合的培養(yǎng)基中生長并且在對數(shù)生長期早期加入乙 醇。然后使用初始培養(yǎng)物對數(shù)生長期末期的細胞來接種新的燒瓶，并 再次在對數(shù)期早期加入增量的乙醇。重復該步驟，同時重復在對數(shù)期 早期向所述培養(yǎng)基中加入增量的乙醇。可以對本發(fā)明中所用的嗜熱微生物進行修飾以中斷或增強與乙醇 生物合成相關(guān)的生物化學途徑中所涉及的基因的表達，例如中斷乳酸 脫氫酶基因。這會引導丙酮酸代謝背離生產(chǎn)乳酸的方向而朝向生產(chǎn)乙 醇的方向，并且在乳酸陰性突變體中觀察到乙醇水平升高。使乳酸脫氳酶基因失活有助于防止丙酮酸降解成乳酸，并且因此 利用丙酮酸脫羧酶和醇脫氬酶促進(在適合條件下)丙酮酸降解成乙 醇。所述野生型微生物可以是任何嗜熱微生物，但是所述微生物優(yōu)選 地為桿菌屬種(fifl'7/ws^1/1)。所述孩i:生物特別優(yōu)選地為地芽孢桿菌屬 種((^^'c/〃ws species )，特別是熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(G ^''〃wsf/^附Og/wCOS7'f/fls/附)。所述微生物可以是'野生型'的，即它們不是實驗室產(chǎn)生的突變 體。所述微生物分離自預計含嗜熱生物的環(huán)境樣品。所分離的野生型 微生物具有生產(chǎn)乙醇的能力，但是由于未經(jīng)修飾，主要的發(fā)酵產(chǎn)物可 能是乳酸。還根據(jù)分離林在高溫下利用己糖和/或戊糖生長的能力來對 它們進行篩選。也可以使用非野生型突變體微生物。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物具有某些能使得所述微生物被用于發(fā)酵 過程的所需特征。所述微生物應(yīng)優(yōu)選地不具有限制性系統(tǒng)，因此避免了體內(nèi)曱基化的需要。此外，所述微生物應(yīng)具有利用C5和C6糖(包 括纖維二糖和淀粉)作為底物的能力。優(yōu)選地，所述微生物可以以高 頻率轉(zhuǎn)化。此外，所述微生物在連續(xù)培養(yǎng)中的生長率應(yīng)在0.3小時—1 以上。所述微生物可為嗜熱生物并且可在40。C-85。C的溫度范圍內(nèi)生長。 優(yōu)選地，所述微生物在50。C-70。C的溫度范圍內(nèi)生長。此外，所述微生 物在pH 6.5或更低的條件下生長，特別是pH 6.5-pH 4.5的條件下生 長是理想的。乳酸脫氫酶的核酸序列現(xiàn)在是已知的。使用這一序列，本領(lǐng)域技 術(shù)人員能靶向乳酸脫氫酶基因以通過不同機制來實現(xiàn)該基因的失活。 優(yōu)選地，乳酸脫氫酶基因是通過插入轉(zhuǎn)座子來失活的或者優(yōu)選地是通 過缺失該基因序列或該基因序列的一部分來失活的。優(yōu)選通過缺失， 因為缺失避免了基因序列再活化的難題，所述基因序列再活化這一難 題在采用轉(zhuǎn)座子失活法時會經(jīng)常遇到。在一個優(yōu)選的實施方案中，所 述乳酸脫氫酶基因是通過整合一個溫度敏感質(zhì)粒(質(zhì)粒pUB190-ldh) 來失活的，這實現(xiàn)了質(zhì)粒與微生物染色體之間的天然同源重組或整合。 根據(jù)染色體的整合體對抗菌劑(卡那霉素)的抗性來對其進行篩選。 乳酸脫氫酶基因內(nèi)的整合可通過單次交換重組事件或通過兩次(或多 次)交換重組事件來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述微生物含有異源的醇脫氫酶基因 和異源的丙酮酸脫羧酶基因。這些異源基因的表達會導致這樣一些酶 的產(chǎn)生，所述酶會將所述代謝重新定向以使得乙醇成為主要的發(fā)酵產(chǎn) 物。這些基因獲自通常進行需氧發(fā)酵的微生物，包括酵單胞菌屬(Z戶O附0觸S )種，包括運動發(fā)酵單抱菌(Z戸O附OMflS附o6/〃S )。用于制備和將這些基因引入微生物中的方法是已知的，例如Ingram et al， Biotech & BioEng， 1998;58(2+3): 204-214和US 5916787,其內(nèi)容均通過引用的方式納入本說明書。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是， 所述基因可以用質(zhì)粒引入或是被整合到染色體中。根據(jù)所選擇的嗜熱微生物，可在常規(guī)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)本發(fā)明的 微生物。根據(jù)已知的培養(yǎng)要求來選擇底物、溫度、pH和其它生長條件， 例如參見WO01/49865和WO01/85966。表1、 2和3中示出了適合的 培養(yǎng)和發(fā)酵條件表l化學試劑體積/L終濃度NaH2P04 2H2025 mMK2S0410 mM
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