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一、光學(xué)顯微鏡
顯微鏡的發(fā)明和使用，使得人類可以從植物的組織和細(xì)胞層次揭示植物的奧秘，認(rèn)識植物的生命活動規(guī)律。隨著顯微鏡的不斷改進(jìn)和提高，出現(xiàn)了適應(yīng)于不同需要的各種特殊顯微鏡。光學(xué)顯微鏡技術(shù)是經(jīng)典的技術(shù)，迄今仍然是研究植物細(xì)胞和組織的重要技術(shù)。
（一）普通光學(xué)顯微鏡
普通光學(xué)顯微鏡是最常用的光學(xué)顯微鏡，它以透射光作為照明光源，又稱明視野顯微鏡。其他許多種類的顯微鏡都是在此基礎(chǔ)上，根據(jù)光學(xué)的現(xiàn)象和規(guī)律，適當(dāng)?shù)馗难b而成。
1 .基本原理 顯微鏡通過透鏡放大被檢物體，其成像原理和光路圖如圖3-1所示。被檢物體AB放在物鏡（L1）前方的1～2倍焦距之間，則在物鏡（L1）后方形成一個倒立的放大實像A1B1，這個實像正好位于目鏡（L2）的焦點之內(nèi)，通過目鏡后形成一個放大的虛像A2B2。這個虛像通過調(diào)焦裝置使其落在眼睛的明視距離處，使所看到的物體最清晰，也就是說虛像A2B2是在眼球晶狀體的兩倍焦距之外，通過眼球后在視網(wǎng)膜形成一個倒立的A2B2縮小像A3B3。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 顯微鏡由光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成（圖3-2）。光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡和照明裝置，機(jī)械裝置主要包括鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器和調(diào)焦裝置等。 顯微鏡的主要性能包括分辨力、放大率、焦點深度、鏡像亮度和視場亮度等。分辨力指能夠區(qū)分的相近兩點間的最小距離，兩點間的距離越小，表示顯微鏡的分辨力越高。顯微鏡的分辨力可用公式R=0.61λ/(nsinα) 表示，其中R為分辨力，λ為光波波長，n為物鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率，α為透鏡角孔徑，指從位于物鏡光軸上標(biāo)本的一個點發(fā)出光線伸長到物鏡前透鏡的有效直徑的兩端所形成的夾角的一半（圖3-3）。nsinα又稱鏡口率。放大率也稱放大倍數(shù)，指最終成像的大小與原物體大小的比值，顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡的放大倍數(shù)的乘積。焦點深度指當(dāng)焦點對準(zhǔn)物體某一點時，不僅位于該點平面上的各點都可看得清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個清晰部分的厚度就是焦點深度。焦點深度與總放大率和鏡口率成反比，因此，高放大率和高鏡口率的顯微鏡其焦點深度淺，不能看到標(biāo)本的全厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋，仔細(xì)地從上到下進(jìn)行觀察。鏡像亮度是顯微鏡的圖像亮度的簡稱，指在顯微鏡下所觀察到的圖像的明暗程度。使用時，對鏡像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不覺得耀眼。鏡像亮度與鏡口率平方成正比，與總放大倍數(shù)的平方成反比。視場亮度是指顯微鏡下整個視場的明暗程度，不僅與目鏡、物鏡有關(guān)，還直接受聚光鏡、光闌和光源等因素的影響。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場亮度大，鏡像亮度也就大。 3. 基本應(yīng)用 普通光學(xué)顯微鏡被廣泛地應(yīng)用于各學(xué)科領(lǐng)域中，它是用來觀察、記錄和研究經(jīng)過制片技術(shù)處理后被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)的最主要的光學(xué)精密儀器。能夠用這類顯微鏡觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞壁、紋孔、線粒體、質(zhì)體、液泡、核和核仁等，均稱為細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。
?。ǘ┫嗖铒@微鏡
相差顯微鏡是利用特殊的相差裝置，使光波通過樣品時把光程差變?yōu)檎穹?，以增大透明物體的明暗反差，從而可以用來觀察未染色的活體組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡。
1. 基本原理 相差顯微鏡的基本原理如圖3-1-4所示，從光源射出的光通過標(biāo)本時，如果標(biāo)本是完全均質(zhì)透明的物體，光將繼續(xù)前進(jìn)，稱為直射光；若某部分含有折射率不同的物質(zhì)時，由于光的衍射現(xiàn)象則向周圍側(cè)方分散前進(jìn)，這種光振幅較小，相位延后，稱為衍射光。當(dāng)直射光和衍射光兩個光波同時達(dá)到一點時，則相互干涉，形成合成波。合成波的大小取決于兩個光波的振幅和相位差。如果振幅相等，相位差為零，其合成波則有兩倍的振幅，產(chǎn)生相長干涉，最為明亮；若一個光的相位推遲，其合成波振幅減小，光亮變暗；當(dāng)一個光波恰好推遲半個波長時，則兩個光波的振幅相抵消，產(chǎn)生相消干涉，成為黑暗狀態(tài)。如果合成波的振幅比背景光的振幅大，則稱為明反差（負(fù)反差）；如果合成波的振幅比背景光的振幅小，則稱為暗反差（正反差）。光線的相位差并不為肉眼所識別，通過光的干涉和衍射現(xiàn)象，相位差變成了振幅差，即明暗之差，肉眼因此得以識別。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 與普通光學(xué)顯微鏡相比，相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計，用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡代替普通物鏡（圖3-5）。相差板是安裝在相差物鏡后面的裝置。相差板分為兩部分，一是通過直射光的部分，叫共軛面，通常呈環(huán)狀，另一部分是繞過衍射光的部分，叫補償面，位于共軛面的內(nèi)外兩側(cè)。相差板上裝有吸收膜及推遲相位的相位膜。相差板除推遲直射光或衍射光的相位以外，還有吸收光量使光度發(fā)生變化的作用。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，安裝在聚光鏡下面，光線只能通過環(huán)狀光闌的透明部分射入。不同倍數(shù)的相差物鏡要用相應(yīng)的環(huán)狀光闌。光線從聚光鏡下的環(huán)狀光闌的縫隙射入直射光，照射到被檢物體上，產(chǎn)生直射光和衍射光兩種光波。在物鏡的后焦面上，設(shè)有相差板，直射光通過共軛面，衍射光通過補償面。背景為直射光，成像為直射光和衍射光的合成波。 3. 基本應(yīng)用 相差顯微鏡最基本的應(yīng)用是觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，可用新鮮的活材料，也可用固定材料，但無論用哪種材料都不宜過厚，一般以不超過20μm。制作切片所用的載玻片也須講究質(zhì)量，要均勻一致，厚度在1mm左右，玻片過厚時，亮環(huán)就不能與相差板的圓環(huán)一致。
（三）暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡以丁達(dá)爾效應(yīng)為基礎(chǔ)，通過特殊的集光器，使照射樣品的直射光不能進(jìn)入物鏡，只有被樣品表面所反射或所衍射的散射光進(jìn)入物鏡，因而在黑暗的視野中形成物體明亮的像。暗視野顯微鏡具有較高的分辨力，它主要被用于觀察未染色的標(biāo)本。
1. 基本原理 當(dāng)來自集光器的入射光由于斜度的增加落在物鏡的孔徑之外時，這種光將不能直接參與像的形成。作為在標(biāo)本上折射、反射和干涉的結(jié)果在各個方向上被散射的光將部分地被物鏡所捕獲。由于直射光線不能進(jìn)入物鏡，當(dāng)光路中沒有物體時，整個視野是完全黑暗的，因此稱為暗視野。但是如果把一個物體放在光路中時，它將反射來自照明器的部分光而成為小的光源。當(dāng)這種物體衍射點的亮度在中間像上足夠強(qiáng)時，它在顯微鏡中將能被分辨。暗視野中的像主要是由在具有不同折射率的界面上產(chǎn)生的散射光形成的，因此所形成的物體的像是不可靠的，它不能表示物體的真實結(jié)構(gòu)，它只是勾畫了物體的輪廓，只能看到物體的存在和運動。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 對于暗視野顯微鏡來說，必須有一個專門的照明系統(tǒng)，這個系統(tǒng)應(yīng)該滿足以下要求：照明光線要有足夠的傾斜度，以保證沒有直接射入物鏡的光錐；較強(qiáng)的光源；集光器必須有調(diào)中裝置。實際上，普通顯微鏡換上暗視野聚光器或用中心擋光法，即可取得暗視野效果。就其構(gòu)造來說，常用的暗視野集光器有以下幾種：拋物面聚光器；心形面聚光器；明暗兩用聚光器；輝光聚光器；同心球面聚光器等。其中以拋物面聚光器最為常用。拋物面聚光器是一個單透鏡，周圍傾斜度較小的拋物線形式（圖3-6）。由顯微鏡的反光鏡反射出的光線，被聚光器的中部遮光板所阻擋，但側(cè)面光線則自由進(jìn)入遮光板旁和透鏡邊緣之間的縫隙。這些光線在聚光鏡凹面上發(fā)生折射，結(jié)果光線集中到聚光器的界面以外，處于觀察標(biāo)本的平面上。 3. 基本應(yīng)用 暗視野顯微鏡觀察物體時，主要觀察的是物體的幾何輪廓，分辨不清內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)，適合于觀察具有規(guī)則結(jié)構(gòu)的物體，例如硅藻、放線菌等；或具有線性結(jié)構(gòu)的物體，如鞭毛、纖維；以及細(xì)菌、單細(xì)胞浮游生物、懸浮細(xì)胞等非常微小的生物體。
（四）熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用一定波長的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生不同顏色的熒光，用來觀察和分辨樣品中某些物質(zhì)及其性質(zhì)的一種顯微鏡。
1. 基本原理 用于顯微觀察中的熒光可以分為自發(fā)熒光和繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱為原發(fā)熒光，它是指由一個物質(zhì)的自然性質(zhì)所產(chǎn)生的熒光，如葉綠素在可見光的激發(fā)下會產(chǎn)生紅色熒光。繼發(fā)熒光是由已經(jīng)被結(jié)合到顯微鏡標(biāo)本成分中的具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光，如細(xì)胞中的DNA經(jīng)吖啶橙染色后，就可以發(fā)出黃綠色的熒光。熒光顯微鏡利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)，發(fā)出一定波長的光作為激發(fā)光，能激發(fā)標(biāo)本的熒光物質(zhì)使其發(fā)出一定的熒光，通過物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。在強(qiáng)烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也容易清晰辨認(rèn)，靈敏度高。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區(qū)別是熒光顯微鏡具有熒光光源和濾色系統(tǒng)（圖3-7）。熒光光源常用的有高壓汞燈和氙燈。濾色系統(tǒng)由激發(fā)濾光片和阻斷濾光片組成。激發(fā)濾光片放置于光源和物鏡之間，其作用是選擇激發(fā)光的波長范圍。阻斷濾光片是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡，防止激發(fā)光干擾熒光和損傷眼睛，并可選擇特異的熒光通過，從而表現(xiàn)出專一性的熒光色彩。 3. 基本應(yīng)用 熒光顯微鏡可觀察固定的切片標(biāo)本，也可在活體染色后進(jìn)行活細(xì)胞的觀察。因此，有關(guān)細(xì)胞與組織中物質(zhì)的吸收與運輸，化學(xué)物質(zhì)的分布與定位等問題，均可利用這種顯微鏡進(jìn)行研究。 ?。ㄎ澹┑怪蔑@微鏡
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來自： 百眼通 > 《01總論-718》
