如何快速掌握光學(xué)顯微鏡使用及拍照的方法

顯微鏡是醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中常用的基本儀器之一，是觀察物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的重要工具。在醫(yī)院臨床上診斷疾患或確定病灶時(shí)，可為醫(yī)務(wù)工作者提供科學(xué)而準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，進(jìn)而提高了醫(yī)療質(zhì)量和醫(yī)務(wù)工作者的水準(zhǔn)。出于對醫(yī)學(xué)的總結(jié)和積累，更多的經(jīng)典病歷需要被保存下來。如此這般，顯微鏡的拍照功能便顯得尤為重要。

那么該如何進(jìn)行顯微鏡鏡下拍照呢？數(shù)字化顯微鏡無疑是最好的選擇，但是數(shù)字化顯微鏡并沒有普及到每個醫(yī)院，只有部分醫(yī)院才配備。這里推薦一種低成本的方法：使用泰立瑞顯拍助手，用手機(jī)為顯微鏡鏡下拍照，完成顯微鏡的數(shù)字化升級。

拍照的問題解決后，該怎樣快速正確使用顯微鏡拍照呢？作者體會總結(jié)如下。

一  方法

1.1放大倍數(shù)選擇

在使用顯微鏡時(shí)，首先要根據(jù)使用者要求，調(diào)整適當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)。在物鏡的辨別中，以往只根據(jù)物鏡上所標(biāo)的數(shù)字去辨認(rèn)。作者總結(jié)出更簡單的辨認(rèn)方法:一是從物鏡的長短辨別，長者為高倍，短者為低倍。二是根據(jù)顏色標(biāo)記上辨認(rèn)，帶有黃周的為低倍10x，帶有綠周的為低倍20 x，帶有藍(lán)圈的為高倍40，帶有白圈的為更高倍100x。按照這兩種方法去辨認(rèn)物鏡的放大倍數(shù)，簡便易行，明顯地縮短了選用所需物鏡的時(shí)間。

1.2聚光鏡孔徑光闌調(diào)整

正確調(diào)整聚光鏡孔徑光闌的大小，可提高成像的襯度。對染色的細(xì)胞和組織，孔徑光闌是物鏡數(shù)值孔徑的80%(如10x物鏡數(shù)值孔徑為0.35，孔徑光闌則為0.24) 。40x物鏡孔徑光闌是 0.6、100x 物鏡孔徑光闌是1. 08。但對未染色的細(xì)胞和組織，孔徑光闌一定要小于物鏡數(shù)值孔徑的80%，或者把聚光鏡高度降低，細(xì)胞和組織才能看清楚。

1.3聚焦問題

轉(zhuǎn)動粗調(diào)手輪，使載物臺降至最低位置，將標(biāo)本放在載物臺上，用標(biāo)本片夾固定。把10x物鏡切入光路對樣品聚焦，將聚光鏡升至最高位置?？s小視場光闌，在視場中可見邊緣模糊的視場光闌圖像，微降聚光鏡，至視場光闌的圖像清晰聚焦為止。用聚光鏡兩個調(diào)中的螺桿把縮小的視場光闌圖像調(diào)至視場中心，開放視場光闌直到光闌圖像周邊與視場邊緣相接。

1.4物鏡與玻片距離

掌握好不同放大倍數(shù)的物鏡與玻片的大致距離很重要。在使用10x物鏡時(shí)，物距在1cm 左右。在使用高倍物鏡時(shí)，其物距的臨界值在1mm左右，在臨界值附近密切注視顯微鏡內(nèi)視野變化，從而提高找到清晰物像的速度。

1.5蓋玻片的厚度問題

數(shù)值孔徑較小的物鏡(比如10x)成像質(zhì)量很少受到蓋玻片的影響，其影響程度隨倍率提高而增加。40x物鏡蓋玻片厚度要求0.17mm，蓋片過厚在調(diào)焦時(shí)，由于物鏡前透鏡受阻，不能準(zhǔn)焦。蓋片過薄，厚度在0.15mm以下，物鏡的成像質(zhì)量也受影響，因?yàn)槲镧R是按標(biāo)準(zhǔn)蓋片的厚度設(shè)計(jì)的。100x油浸物鏡對蓋玻片無特殊要求，因?yàn)樯w玻片、浸油和載玻片的折射率幾乎相等，不會因蓋片厚度而產(chǎn)生有礙成像質(zhì)量的情況。除非蓋片厚度大于工作距離，否則不必考慮其厚度，對成像質(zhì)量沒有影響。

1.6免疫組化照片拍照

如果拍的是免疫組化照片需要圖像分析，所有照片必須在完全相同的顯微鏡條件下拍攝。在更換樣品時(shí)，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上其他部件都不能動，所有的樣品必須一次性拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要來回切換物鏡。保持每張照片用相同的曝光條件，同樣的曝光時(shí)間，同樣的光圈，特別注意的是一定要把數(shù)碼相機(jī)或手機(jī)的自動白平衡功能關(guān)掉。免疫組化切片拍攝出的照片中空白部位盡可選呈現(xiàn)白色，測量其灰度應(yīng)在230左右。

1.7熒光照片拍照

如果拍的是熒光照片，實(shí)驗(yàn)組和對照組熒光照片需要對比熒光強(qiáng)度，必須設(shè)置為相同的激發(fā)波長，相同的放大倍數(shù)，相同的曝光條件。如果要看細(xì)胞轉(zhuǎn)染率問題，普通光和熒光必須拍攝相同的位置。看有多少細(xì)胞發(fā)熒光，多少細(xì)胞不發(fā) 熒光，用圖像分析軟件進(jìn)行分析，測出轉(zhuǎn)染率。

二、討論

按上述幾點(diǎn)進(jìn)行顯微鏡拍攝，能拍攝出清晰的照片，而且速度特別快，大大縮短了拍攝時(shí)間。在拍照過程中應(yīng)該注意的問題:

①    在低倍鏡下能觀察很清楚的樣品，但在高倍鏡下怎么聚焦也觀察不清楚，說明樣品放反了，即帶有樣品面朝下而不是朝上。另一個原因是未加蓋玻片或是加蓋玻片但厚度不是 O. 17 mm ，最后一個原因是高倍鏡頭臟污。

②    在拍攝免疫組化照 片的時(shí)候，如果照片背景呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動白平衡在起作用，一定要把相機(jī)自動白平衡關(guān)掉。但是一張清晰的照片除了與顯微鏡的性能和照相機(jī)的性能有關(guān)以外，還與制片的質(zhì)量有關(guān)。

應(yīng)注意以下方面:

①    石蠟切片的厚度應(yīng)在3-5μm左右，而且切片厚度必須均勻一致。否則在同一張照片上，有的位置清楚，但有的位置模糊，不在一個平面上。染色必須均勻一致。

②    培養(yǎng)細(xì)胞必須是單層，不能是重疊， 否則也不能準(zhǔn)確聚焦。

③    拍攝的是熒光照片，必須把多余的熒光染料清洗掉，除去雜質(zhì)，一般用0.01 M PBS 清洗。

④    所用的載玻片和蓋玻片必須清潔干凈，厚度符合要求。載玻片厚度0.8-1.2mm，蓋玻片厚度0.17mm。

⑤    封片樹膠不能污染載玻片和蓋玻片的表面。