MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序是基于抗體富集原理進(jìn)行測序的全基因組甲基化檢測技術(shù)，采用甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發(fā)生甲基化的DNA片段，然后通過高通量測序可以在全基因組水平上進(jìn)行高精度的CpG密集的高甲基化區(qū)域研究。

研究人員可以利用MeDIP-Seq技術(shù)快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織或疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。

技術(shù)策略：

技術(shù)優(yōu)勢：

■ 精確度高：基因組位點(diǎn)定位精確性可達(dá)± 50bp。

■ 可靠性高：直接對甲基化片段進(jìn)行測序和定量，無交叉反應(yīng)和背景噪音。

■ 檢測范圍廣：全基因組范圍內(nèi)甲基化區(qū)域研究。

■ 高性價比：通過抗體富集高甲基化區(qū)域進(jìn)行測序，有效降低測序費(fèi)用。


技術(shù)路線：

MeDIP-seq生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)信息分析及個性化分析。信息分析流程如下：

生物信息分析流程圖，首先要對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭去低值處理，然后進(jìn)行比對分析，采用唯一比對的reads進(jìn)行下一步分析。之后對唯一比對reads在基因組，基因元件的分布進(jìn)行分析。檢測到唯一比對的reads的富集區(qū)（Peak），并對Peak進(jìn)行分析。最后進(jìn)行差異Peak的分析。

1. Data clean

測序完成后，去污染，去接頭及去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)信息

2. MeDIP-Seq序列與參考序列的比對

將MeDIP-Seq序列與參考基因組進(jìn)行比對，每條read最多容許2個堿基的錯配，生成最終比對結(jié)果文件 *.sop。

比對信息統(tǒng)計(jì)

有效鏈深度=比對bases數(shù)/基因組參考序列大小

唯一比對率=唯一比對reads數(shù)/原始reads數(shù)量

3. MeDIP-Seq數(shù)據(jù)的全基因組分布趨勢

3.1 MeDIP-seq 測序 reads 在全基因組上的覆蓋深度

計(jì)算全基因組上每一個堿基的覆蓋深度，得到不同覆蓋深度下的堿基百分比，即不同覆蓋深度下的堿基對應(yīng)基因組的覆蓋度。

覆蓋深度：特定位點(diǎn)被測序 reads 所覆蓋的次數(shù)。例如某一個位點(diǎn)上的覆蓋深度為 10X，則表明這個位點(diǎn)被測序 reads 覆蓋了 10 次。而對于特定的 DNA 區(qū)域，或者全基因組范圍，則可以計(jì)算平均覆蓋深度。

基因組覆蓋度：符合特定條件的堿基數(shù)所能覆蓋的全基因組堿基數(shù)的比例。下圖中橫軸表示測序深度，縱軸表示不低于這一特定測序深度的基因組覆蓋度。

3.2 MeDIP-seq 測序 reads 在 CpG 位點(diǎn)上的覆蓋深度

MeDIP-seq 測序reads在CpG位點(diǎn)上的覆蓋深度計(jì)算全基因組上每一個CpG（Watson鏈，Crick鏈，雙鏈）的覆蓋深度，得到不同覆蓋深度下CpG位點(diǎn)的覆蓋度，即一定覆蓋深度以上的CpG位點(diǎn)在MeDIP-seq所測得的全部CpG位點(diǎn)中所占比例。

3.3 MeDIP-Seq測序reads在不同基因功能元件上的分布

對測序reads在9種基因組功能元件上的分布進(jìn)行比較分析，有助于了解不同功能元件的甲基化修飾特征。這9種功能元件包括CpG Islands, Repetitive Elements, gene upstream2k, first exon, first intron, internal exons, internal introns, last exon , downstream2k。另外，在此基礎(chǔ)上對Repetitive Elements區(qū)域進(jìn)一步細(xì)分，統(tǒng)計(jì)reads在不同類型Repeat區(qū)域的分布情況。

橫軸表示不同基因區(qū)域，縱軸表示分布在特定基因區(qū)域的reads占可比對reads總數(shù)的比例。

reads在不同基因功能元件上的分布

reads 在重復(fù)區(qū)域的分布情況

3.4 MeDIP-seq 測序 reads 在不同 GC 含量區(qū)域中的分布

以200bp大小的窗口對基因組進(jìn)行掃描，計(jì)算MeDIP-Seq序列在不同GC含量的窗口的分布情況，可以反映出測序數(shù)據(jù)在不同GC含量區(qū)域的富集性分布特征。

下圖中橫軸代表不同GC含量區(qū)域，縱軸代表特定GC含量區(qū)域的reads總數(shù)占所有可比對reads總數(shù)的比例。

4. 統(tǒng)計(jì) MeDIP-seq 數(shù)據(jù)富集區(qū)域 ( Peak ) 的信息

對 MeDIP-seq 序列進(jìn)行 Peak 掃描，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

4.1 Peak 掃描

全基因組范圍掃描尋找Peak區(qū)域，得到Peak在基因組上的位置信息。

表3-3 Peak信息統(tǒng)計(jì)

4.2 尋找 Peak 相關(guān)基因

根據(jù)Peak掃描的結(jié)果，尋找Peak相關(guān)基因。

4.3 統(tǒng)計(jì)Peak在不同基因功能元件上的分布

分別統(tǒng)計(jì)Peak在upstream2k，first exon，first intron，internal exons，internal introns，last exon，downstream2k等7個基因功能元件上的個數(shù)分布和覆蓋度分布。

下圖中橫軸表示各個功能元件區(qū)域，縱軸表示特定功能元件所包含的peak個數(shù)。

下圖中橫軸表示各個功能元件區(qū)域，縱軸表示特定功能元件區(qū)域所包含的peak在該區(qū)域的覆蓋度（即覆蓋堿基數(shù)與該區(qū)域堿基總數(shù)的比值）。

將每個基因元件按長度平均分成10份，以曲線圖的形式反映每一個功能元件區(qū)域的 peak覆蓋度變化趨勢。

5. 基于 Peak 的多樣品間差異性分析

5.1分析兩個樣品間的 peak 相關(guān)差異基因

基于兩個樣本的MeDIP測序數(shù)據(jù)，針對各基因功能元件區(qū)域的Peak覆蓋度做差異分析，找到具有差異的基因。

篩選條件為：p值≤0.05，兩個樣本在相同基因元件內(nèi)都有覆蓋，且覆蓋度的差異在 4 倍以上。下述表格中的數(shù)值表示差異基因個數(shù)。
 

5.2 對兩個樣品間的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析及pathway功能分析

Peak相關(guān)差異基因所具有的功能聚類，代表兩個樣品在特定生物學(xué)功能上具有與DNA 甲基化修飾相關(guān)的差異性。下圖為差異基因的GO功能分析結(jié)果。橫軸代表GO功能分類項(xiàng)，左縱軸代表與GO相關(guān)的基因的比例，右縱軸代表與GO相關(guān)基因的數(shù)量，每一個特定功能分類項(xiàng)中均列出兩個樣品在此功能分類下的分布情況。

圖中所標(biāo)down與up，是將sample1與sample2進(jìn)行比較后所得到的內(nèi)容，sample2覆 蓋度高于sample1的基因即為up-methylated，反之則為down-methylated。

6. 個性化信息分析

根據(jù)客戶具體項(xiàng)目需求進(jìn)行個性化分析。

案例分析：

MeDIP-Seq發(fā)現(xiàn)種子發(fā)育過程中重復(fù)元件廣泛的去甲基化是基因印記的基礎(chǔ)

在植物中，基因印記現(xiàn)象往往發(fā)生在胚乳中。研究人員以兩個擬南芥品種Col- gl和Ler各自的胚和胚乳為材料，利用medIP測序的手段對全基因組的甲基化譜進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)伴隨著胚乳的發(fā)育以及胚乳特異的一些基因的表達(dá)發(fā)生了大規(guī)模甲基化的變化。胚乳中重復(fù)元件發(fā)生了廣泛的去甲基化。并且，通過將胚乳中甲基化程度降低的區(qū)域與胚乳表達(dá)偏好性(preferential expression in endosperm)關(guān)聯(lián)起來作為候選印記基因的方式，尋找到了新的印記基因。所有的結(jié)果說明植物中印記的發(fā)生來源于在基因調(diào)控元件附近插入重復(fù)元件的甲基化以及之后的正向選擇的原因。

胚與胚乳中甲基化狀況

原文：Extensive Demethylation of Repetitive Elements During Seed Development Underlies Gene Imprinting, Science, 2009