孤獨癥醫(yī)學(xué)論文：干細胞治療自閉癥:安全性和有效性觀察

Abstract
BACKGROUND: Autism is associated with several neurophysiological alterations, especially immune abnormalities and neural hypoperfusion appear to be broadly consistent.
OBJECTIVE: To evaluate the feasibility, safety and efficacy of stem cells for treating autism.
METHODS: A total of 42 children of autism were divided into three groups: umbilical cord blood group, combination group and control group. Umbilical cord blood group was treated with umbilical cord blood mononuclear cells. Combination group was treated with umbilical cord blood mononuclear cells combined with umbilical cord mesenchymal stem cells. Control group received rehabilitation treatment. Related lab examinations were taken for umbilical cord blood and combination groups before treatment, 4 weeks after treatment and 4 months after treatment. Whether there were adverse reactions were observed. Childhood Autism Rating Scale and Clinical Global Impression Scale were employed to assess the children of autism before treatment, 4 weeks and 4 months following first treatment in patients of each group.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no statistical difference in lab examinations between umbilical cord blood and combination groups before treatment, 4 weeks and 4 months following treatment. There were no severe adverse reactions following stem cell treatment. Childhood Autism Rating Scale was significantly decreased in the umbilical cord blood and combination groups before treatment, 4 weeks and 4 months following treatment. Clinical Global Impression Scale demonstrated that total efficiency was greater in the combination group compared with umbilical cord blood group. Results indicated that it is safe to use umbilical cord blood mononuclear cells and umbilical cord mesenchymal stem cells for treating children autism and the therapeutic effect of the umbilical cord blood and combination groups was noticeably higher than that of the control group with rehabilitation treatment.

Liu M, Sun LW, Lü YT, Huan Y, Ge RC, Cao YL, Guo CQ, Chen XW. Stem cells for treatment of autism: Safety and efficacy.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(32): 5967-5970.    

摘要
背景：自閉癥伴隨許多神經(jīng)生理學(xué)上的改變，特別是免疫異常和神經(jīng)系統(tǒng)的組織灌流不足。
目的：評價干細胞治療自閉癥的可行性、安全性和有效性。
方法：42例自閉癥患者隨機分為臍血組、混合組和對照組，臍血組應(yīng)用臍血單個核細胞治療；混合組應(yīng)用臍血單個核細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞治療；對照組行康復(fù)訓(xùn)練治療。臍血組和混合組患者治療前和首次治療后4周、4個月行相關(guān)指標實驗室檢查，并觀察有無不良反應(yīng)發(fā)生。3組患者在治療前、首次治療后4周和4個月分別行兒童自閉癥評定量表(CARS)和臨床總體印象量表(CGI)評估。
結(jié)果與結(jié)論：臍血組和混合組患者在治療前和首次治療后4周、4個月相關(guān)指標實驗室檢查未發(fā)現(xiàn)有顯著異常變化，干細胞治療后無嚴重不良反應(yīng)發(fā)生。臍血組和混合組CARS評分在治療前、首次治療后4周、首次治療后4月之間比較均明顯降低，CGI量表發(fā)現(xiàn)混合組總有效率高于臍血組。結(jié)果提示，應(yīng)用臍血單個核細胞和臍帶間充質(zhì)干細胞治療自閉癥是安全的，其療效顯著高于康復(fù)訓(xùn)練治療。
關(guān)鍵詞：自閉癥；單個核細胞；間充質(zhì)干細胞；臨床評價；安全性
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.32.017

自閉癥是一種以嚴重的、廣泛的社會相互影響和溝通技能損害以及刻板的行為、興趣和活動為特征的疾病，根據(jù)全世界的統(tǒng)計，自閉癥的發(fā)病率大約為萬分之五。自閉癥的癥狀通常在患兒12~18個月時就有表現(xiàn)[1]，但確診卻要在患兒24~36個月時才能做出，有個別的患者甚至到成人時才被診斷患有自閉癥[2]。該病目前尚無特效的治療方法。干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞，目前研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)和改善腦內(nèi)微循環(huán)的功能。近期作者應(yīng)用臍血單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)和臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal Stem Cells，MSCs)治療自閉癥取得較好療效。

1  材料和方法

設(shè)計：對比觀察。
時間及地點：于2009-01/12在山東省交通醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及干細胞治療中心完成。
對象：選取2009-01/12在山東省交通醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院行干細胞治療的自閉癥患者28例，隨機分為臍血組和混合組各14例，其中臍血組男12 例，女2例，年齡最大11歲，最小3歲2個月，平均6.47歲；混合組男12例，女2例，年齡最大10歲，最小3歲3個月，平均6.32歲。另選取在“濟南明天康復(fù)中心”行康復(fù)訓(xùn)練治療的自閉癥患者14例為對照組，其中男11 例，女3例，年齡最大10歲，最小3歲2個月，平均6.41歲。3組患者入選標準：年齡在3~12歲，性別不限；符合DSM-IV兒童自閉癥診斷標準，并有精神科?？漆t(yī)師診斷；兒童自閉癥評定量表(Childhood autism rating scale，CARS)評分≥30分；無其他重大或慢性疾病史。3組患者在年齡、性別組成以及病情輕重程度上經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異，有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查并通過。根據(jù)國務(wù)院《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》規(guī)定[3]，患兒監(jiān)護人知情同意。
方法：
干細胞來源及治療方法：干細胞來自健康分娩孕婦的臍血和臍帶(產(chǎn)婦知情同意)，均經(jīng)過艾滋病毒、梅毒抗體、肝炎標志物5項、Torch5項等檢測，經(jīng)過分離、提取、培養(yǎng)、擴增及傳代4~6代，每份治療細胞數(shù)量為2×106/kg。
干細胞治療次數(shù)：患者1療程共治療4次，治療1次/周。治療方式：臍血組：靜脈輸注1次、腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射3次MNCs；混合組：靜脈輸注1次、腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射1次MNCs，腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射2次MSCs；對照組在“濟南明天康復(fù)中心”由專業(yè)康復(fù)師行感覺統(tǒng)合及行為康復(fù)訓(xùn)練治療。3組患者在研究期間不接受其他治療。
臨床檢查和評價方法
安全性評價：臍血組和混合組患者在治療前和首次治療后4周、4個月行血常規(guī)，肝腎功能、免疫球蛋白、補體C3、C4、T細胞亞群等常規(guī)化驗檢查，觀察兩組患者在研究期間有無嚴重不良反應(yīng)及實驗室指標異常變化作為安全性評價指標。
有效性評價：3組患者行干細胞治療和康復(fù)訓(xùn)練治療前和首次治療后4周、4個月分別進行CARS和臨床總體印象量表(Clinical Global Impression Scale，CGI)評估[4]。病情嚴重程度(severty of illness，SI)，采用0~7分的8級記分法，根據(jù)具體患者的病情與同一研究的其他同類患者比較，作出評定：0分：無病；1分：基本無病；2分：極輕；3分：輕度；4分：中度；5分：偏重；6分：重度；7分：極重。療效總評(global improvement，GI)：采用0~7分的8級記分法。根據(jù)被評者目前病情與入組時相比，作出評定。0分：未評；1分：顯著進步；2分：進步；3分：稍進步；4分：無變化；5分：稍惡化；6分：惡化；7分：嚴重惡化。
設(shè)計、實施、評估者：設(shè)計、實施者為本文作者，評估者為第七作者，評估方式采取雙盲法。
主要觀察指標：血常規(guī)，肝腎功能、免疫球蛋白、補體C3、C4、T細胞亞群等指標；CARS和CGI量表評估。
統(tǒng)計學(xué)分析：定量數(shù)據(jù)采用例數(shù)、均數(shù)、標準差描述，定性數(shù)據(jù)采用頻數(shù)、構(gòu)成比或百分比描述。用SAS統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，3組間比較及治療前后比較采用t 檢驗，以P < 0.05為差異有顯著性意義。

2  結(jié)果

2.1  參與者數(shù)量分析  納入患兒42例，分為3組，無脫落，全部進入結(jié)果分析。
2.2  安全性評價  臍血組和混合組患者在治療前和首次治療后4周、4個月常規(guī)化驗血常規(guī)，肝腎功能、免疫球蛋白、補體C3、C4、T細胞亞群等指標經(jīng)前后比較未發(fā)現(xiàn)有意義異常變化。
臍血組和混合組患者在行干細胞治療后部分病例伴隨有輕微不良反應(yīng)，表現(xiàn)為：低熱12例(43%)，頭痛4例(14%)，腰痛3例(23%)，乏力4例(14%)，惡心、嘔吐2例(7%)，經(jīng)過對癥處理后，均在一兩天內(nèi)癥狀消失，無嚴重不良反應(yīng)發(fā)生。
2.3  功能量表評價  臍血組和混合組CARS評分在治療前、首次治療后4周、首次治療后4個月組內(nèi)之間比較均有顯著性改善。對照組在治療前、首次治療后4周、首次治療后4個月之間比較差異無顯著性意義，見表1~3。

   

 3組患者經(jīng)CGI病情嚴重程度(severty of illness,SI)評分發(fā)現(xiàn)在首次治療后4周和首次治療后4月均有不同程度改善，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無顯著性意義，見表4。

經(jīng)CGI療效總評(global improvement,GI)量表評估發(fā)現(xiàn)首次治療后4周、首次治療后4月臍血組總有效率分別為71%、71%，混合組總有效率分別為79%，93%，對照組總有效率分別為21%，43%，混合組高于臍血組，臍血組高于對照組，見表5。

3  討論

3.1  相關(guān)知識點  自閉癥又稱孤獨癥，由Kanner在1943年首次對該病進行了報道，該病患病率各國報道不一，在中國為0.002%。自閉癥具體致病機制尚不明確，目前研究認為盡管自閉癥伴隨有許多神經(jīng)生理學(xué)上的改變，但更多的變化是免疫異常和神經(jīng)系統(tǒng)的組織灌流不足，有人認為這是自閉癥的主要病因。國外研究發(fā)現(xiàn)在自閉癥患兒腦中有顳葉特殊區(qū)域灌流不足的表現(xiàn)，可以導(dǎo)致認知[5]，社會交往以及語言能力的下降[6-7]，支持了組織灌流不足是自閉癥致病因素之一的觀點。這種缺陷包括了基礎(chǔ)循環(huán)的灌流不足以及在受刺激下組織灌流減少[8-9]。此外，免疫功能異常也與自閉癥的發(fā)生密切相關(guān)。國外研究發(fā)現(xiàn)自閉癥患兒體內(nèi)能檢測出多種自身免疫抗體，這些自身免疫抗體包括髓磷脂基礎(chǔ)蛋白抗體[10]、腦提取物抗體[11-12]、蒲肯野細胞和麥醇溶蛋白抗體[13]，中性因子抗體以及神經(jīng)元軸突絲和神經(jīng)膠質(zhì)纖維蛋白抗體[14-16]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)自閉癥患兒的家庭成員與正常對照組相比更容易罹患自身免疫疾病[17]。國外報道自閉癥患兒存在著全身性的T細胞和B細胞的功能異常。這些異常包括了系統(tǒng)性的T淋巴細胞減少，對絲裂原的反應(yīng)增殖減少以及細胞因子的產(chǎn)生異常[18]。Vargas等[19]通過比較自閉癥患兒與正常兒童的尸檢標本，發(fā)現(xiàn)在自閉癥患者的大腦皮質(zhì)、白質(zhì)，特別是在小腦中存在著神經(jīng)組織炎癥病變。自閉癥患者普遍存在類似自身免疫的病理生理學(xué)的改變，由此推斷自身免疫也是致病因素之一。
自閉癥目前無特效治療，通過行為干預(yù)、特殊教育和康復(fù)訓(xùn)練等方法，可以提高他們在日常生活中自理、認知及適應(yīng)社會的能力，但療效有限。作者應(yīng)用臍血和臍帶干細胞治療自閉癥取得了較好療效。臍血中主要為MNCs，其中CD34+細胞已被證實有促血管生成的能力，不僅對外周組織缺血，而且對腦缺血都有肯定的治療作用，臍血已被成功的運用于不同的缺血模型并被證實能刺激血管生成。文獻報道含有CD34+以及相當于一半CD34+細胞數(shù)量CD11b+細胞的臍血被證實擁有分化為內(nèi)皮細胞的能力[20]。免疫能力缺陷的大鼠結(jié)扎大腦中動脈后，運用臍血CD34+細胞可減少神經(jīng)缺損并誘導(dǎo)神經(jīng)再生，部分作用是通過分泌血管生成因子來實現(xiàn)的[21]。臍帶中MSCs含量豐富，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，具有非特異性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力，它是通過抑制成熟樹突細胞及其抗原表達能力來實現(xiàn)的，MSCs還能影響B細胞的活力、增殖和分化，抑制T細胞觸發(fā)的增殖及細胞因子的產(chǎn)生。MSCs的另一個重要的特性就是具有分泌免疫阻斷因子如白細胞介素10和轉(zhuǎn)化生長因子β的能力，同時保持著對T細胞表達抗原的能力[22]。
本組實驗發(fā)現(xiàn)單用MNCs或聯(lián)合MNCs和MSCs治療自閉癥均有顯著療效，總有效率達70%以上，明顯高于對照組的傳統(tǒng)康復(fù)訓(xùn)練治療。作用機制如下：干細胞進入體內(nèi)可調(diào)節(jié)機體免疫功能，并通過自身分化和分泌細胞因子和神經(jīng)肽刺激新生血管形成，改善腦內(nèi)缺血缺氧狀態(tài)，激活和修復(fù)腦內(nèi)受損的神經(jīng)細胞。臍血組和混合組之間比較差異無顯著性意義，但總有效率混合組高于臍血組，分析可能與MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)，MNCs聯(lián)合MSCs會對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療產(chǎn)生協(xié)同作用。CGI(SI)量表在療效上只是粗略分級，可能是導(dǎo)致兩組間在治療前后差異無顯著性意義的主要原因。兩組之間的療效比較需要進一步增大樣本量繼續(xù)觀察研究。
本組實驗同時表明應(yīng)用干細胞治療自閉癥是安全的，治療前后相關(guān)指標對比未發(fā)現(xiàn)有意義異常變化，治療過程中及治療后未發(fā)現(xiàn)有嚴重不良反應(yīng)發(fā)生，少數(shù)病例出現(xiàn)低熱、頭痛、腰痛、惡心、乏力等表現(xiàn)與輕微免疫反應(yīng)和腰椎穿刺腦脊液壓力變化有關(guān)，經(jīng)過對癥處理后癥狀在一兩天內(nèi)均得到緩解。
3.2  文章的偏倚或不足  文章對干細胞治療自閉癥的安全性和臨床療效進行了觀察研究，但對其發(fā)揮療效的確切機制及相關(guān)實驗室指標未進行進一步的探討。此外，對干細胞治療自閉癥的遠期療效未進行觀察評估，希望在以后的工作中進行進一步的觀察和研究。
3.3  提供臨床借鑒的意義  目前自閉癥的治療方法有行為、營養(yǎng)和藥物這3條途徑，但療效均有限，本組實驗發(fā)現(xiàn)單用MNCs或聯(lián)合應(yīng)用MNCs和MSCs治療自閉癥是安全的，其療效顯著高于傳統(tǒng)的康復(fù)訓(xùn)練治療。實驗有望為自閉癥的治療尋求一條更加有效的途徑，對減輕社會和家庭負擔，提高患者生活質(zhì)量具有重要的意義。

4  參考文獻

[1] Mitchell S, Brian J, Zwaigenbaum L, et al.Early language and communication development of infants later diagnosed with autism spectrum disorder. J Dev Behav Pediatr.2007;27:S69-78.
[2] Filipek PA, Accardo PJ, Baranek GT, et al.: The screening and diagnosis of autistic spectrum disorders. J Autism Dev Disord. 2009; 29:439-484.
[3] State Council of the People's Republic of China. Administrative Regulations on Medical Institution. 1994-09-01. 中華人民共和國國務(wù)院.醫(yī)療機構(gòu)管理條例.1994-09-01.
[4] 吳文源. 臨床療效總評量表(CGI)[M].∥張明園. 精神科評定量表手冊. 長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1998:150-153.
[5] Bachevalier J.Medial temporal lobe structures and autism: a review of clinical and experimental findings. Neuropsychologia. 1994;32:627-648.
[6] Gillberg IC.Autistic syndrome with onset at age 31 years: herpes encephalitis as a possible model for childhood autism. Dev Med Child Neurol.1991;33:920-924.
[7] Lipkin WI, Hornig M.Microbiology and immunology of autism spectrum disorders. Novartis Found Symp.2003;251:129-143.
[8] Ryu YH, Lee JD, Yoon PH,et al.Perfusion impairments in infantile autism on technetium-99m ethyl cysteinate dimer brain single-photon emission tomography: comparison with findings on magnetic resonance imaging. Eur J Nucl Med .2009;26:253-259.
[9] Bruneau N, Dourneau MC, Garreau B, et al.Blood flow response to auditory stimulations in normal, mentally retarded, and autistic children: a preliminary transcranial Doppler ultrasonographic study of the middle cerebral arteries. Biol Psychiatry .2007;32:691-699.
[10] Singh VK, Warren RP, Odell JD, et al.Antibodies to myelin basic protein in children with autistic behavior. Brain Behav Immun. 2008; 7:97-103.
[11] Silva SC, Correia C, Fesel C, et al. Autoantibody repertoires to brain tissue in autism nuclear families. J Neuroimmunol 2008;152: 176-182.
[12] Singer HS, Morris CM, Williams PN, et al.Antibrain antibodies in children with autism and their unaffected siblings. J Neuroimmunol. 2007;178:149-155.
[13] Vojdani A, O'Bryan T, Green JA, et al.Immune response to dietary proteins, gliadin and cerebellar peptides in children with autism. Nutr Neurosci.2008;7:151-161.
[14] Connolly AM, Chez M, Streif EM, et al.Brain-derived neurotrophic factor and autoantibodies to neural antigens in sera of children with autistic spectrum disorders, Landau-Kleffner syndrome, and epilepsy. Biol Psychiatry.2007;59:354-363.
[15] Kozlovskaia GV, Kliushnik TP, Goriunova AV,et al.[Nerve growth factor auto-antibodies in children with various forms of mental dysontogenesis and in schizophrenia high risk group]. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova .2008;100:50-52.
[16] Sweeten TL, Bowyer SL, Posey DJ,et al.Increased prevalence of familial autoimmunity in probands with pervasive developmental disorders. Pediatrics.2008;112:e420.
[17] Comi AM, Zimmerman AW, Frye VH, et al.Familial clustering of autoimmune disorders and evaluation of medical risk factors in autism. J Child Neurol.1999;14:388-394.
[18] Cohly HH, Panja A.Immunological findings in autism. Int Rev Neurobiol.2005;71:317-341.
[