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歷史

　　1906年俄國植物化學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”（Chromotography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。他在論文中寫到： 　　“（原文）一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖。” 　　1930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。 　　1952年，英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們在分配色譜方面的研究工作，提出了關(guān)于氣－液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。 　　1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試，但分離效率尚不理想。 　　1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐的發(fā)展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。 　　1970年中期以后，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。 　　1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。

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特點(diǎn)

　　高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點(diǎn)： 　?、俑邏海毫鲃?dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。 　?、诟咝В悍蛛x效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 　?、鄹哽`敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級(jí)。 　?、軕?yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。 　?、莘治鏊俣瓤?、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。 　　此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

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結(jié)構(gòu)組成

　　高效液相色譜儀可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進(jìn)樣器”、“檢測器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。

高壓輸液泵

　　功能 　　驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)； 　　性能要求 　　流量穩(wěn)定（±1），耐高壓（30～60Mpa），耐各種流動(dòng)相：例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液； 　　種類 　　往復(fù)泵和隔膜泵。

色譜柱

　　功能 　　分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)； 　　尺寸 　　10～30cm長，2～5mm內(nèi)經(jīng)的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱； 　　填料粒度 　　5 ～ 10μm ，高效微粒固定相；

進(jìn)樣器

　　功能 　　將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)； 　　種類 　?、僮⑸淦?，10Mpa以下，1～10μm微量注射器進(jìn)樣 　?、谕Ａ鬟M(jìn)樣 　?、坶y進(jìn)樣，常用、較 理想、體積可變，可固定 　?、茏詣?dòng)進(jìn)樣器，有利于重復(fù)操作，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 　　

檢測器

　　功能 　　將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào)； 　　分類 　?、偈静钫酃饣瘜W(xué)檢測器 　　②紫外吸收檢測器 　?、圩贤庖豢赏止夤舛葯z測器 　　④二極管陣列紫外檢測器 　?、轃晒鈾z測器 　?、?a target=_blank>電化學(xué)檢測器

餾分收集器

　　功能 　　如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的； 　　方法 　?、偈止ぃ贁?shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。 　　②餾分收集器收集，比較理想，微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。

數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)

　　功能 　　把檢測器檢測到的信號(hào)顯示出來。

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流程

　　 流程：如右圖所示，溶劑貯器（1）中的流動(dòng)相被泵（2）吸入，經(jīng)〔3〕梯度控制器按一寫的梯度進(jìn)行混后然后輸出，經(jīng)（4）測其壓力和流量，導(dǎo)入（5進(jìn)樣閥（器）經(jīng)（6）保護(hù)柱、（7）分離柱后到（8）檢測器檢測，由（10）數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理數(shù)據(jù)或（11）記錄儀記錄色譜圖，（12）餾分收集器收集餾分，（13）為廢液。

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使用方法

　　色譜柱的填料和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 　　在用紫外吸收檢測器時(shí),所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求。 　　正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變, 　　以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。 2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 　　按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整,應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子. 　　

色譜柱的理論板數(shù)

　　在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。 　　

分離度

　　定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計(jì)算公式為：　2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。

拖尾因子

　　為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定,或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為： 　　W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； 　　d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05間。 　　也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80％、100％和120％的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計(jì)算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％。

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測定方法

　　定量測定時(shí)，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)總量時(shí)，須采用峰面積法。 　　

面積歸一化法

　　測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜圖的記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定，除另有規(guī)定外,可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。 　　

主成分自身對照法

　　 　　當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。 　　

內(nèi)標(biāo)法

　　測定供試品中雜質(zhì)的總量限度 　　采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖Ｉ；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30％以上，否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測器靈敏度。 　　如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計(jì)在內(nèi)）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。 　　加校正因子測定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量

　　按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子： 　　As／ms]校正因子f＝- Ar／mr 式中 As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，Ar為對照品的峰面積或峰高； ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量,mr為加入對照品的量。 再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質(zhì)）峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax 含量（mx）＝f×-As／ms 式中 Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； mx為供試品（或其雜質(zhì)）的量。 f、As和ms的意義同上。 　　當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。 　　

外標(biāo)法

　　測定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 　　按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量： 　　A<[x]> 含量（mx）＝mr×-Ar式中各符號(hào)意義同上 　　由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。

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實(shí)例

　　 高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質(zhì)的分析。 　　左圖示是其用于有機(jī)氯農(nóng)藥的測定： 　　采用液一固色譜法，固定相：薄殼硅膠CorasilⅡ（37~50μm）；流動(dòng)相：正己烷；色譜柱：50cm×2.5mm內(nèi)徑；流速：1.5ml/min；檢測器：示差折光 　　1－艾氏劑、2－p，p’－DDT、3－p，p’－DDD、4－γ－666、5－恩氏劑。