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大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。 RNA和DNA中的化學(xué)修飾在多種生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA降解、蛋白質(zhì)翻譯和免疫調(diào)節(jié)等。這些修飾已被新的測序方法以單堿基分辨率定量地繪制出來，其中核苷酸脫氨基是一種高效策略，用于選擇性地繪制DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）和RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)脫氨基方法依賴于在苛刻的酸性條件下使用芳基重氮鹽，這限制了其在大多數(shù)生物底物中的應(yīng)用。近年來，基于亞硝酸鹽離子的RNA測序方法（如NO-seq和NT-seq）雖然簡單且成本效益高，但低轉(zhuǎn)化效率和苛刻的酸處理可能會導(dǎo)致RNA降解，從而影響檢測的準(zhǔn)確性。此外，GLORI方法雖然提高了脫氨基效率和選擇性，但仍受到RNA降解和逆轉(zhuǎn)錄停止的限制，需要大量的RNA輸入。 為了開發(fā)一種溫和的化學(xué)脫氨基反應(yīng)，以克服傳統(tǒng)方法的局限性。近日，芝加哥大學(xué)何川團(tuán)隊通過設(shè)計一種接近中性pH值的溫和化學(xué)脫氨基反應(yīng)，不僅可以顯著保護(hù)RNA，還能提高信噪比，從而實現(xiàn)對m6A位點的靈敏且穩(wěn)健繪制。這種方法有望為研究m6A修飾在基因表達(dá)調(diào)控中的作用提供有力的工具，推動RNA修飾領(lǐng)域的研究進(jìn)展。相關(guān)成果以《Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA》為題，發(fā)表于Nature子刊《Nature Chemistry》。
標(biāo)題：Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA 發(fā)表時間：2025-4-17 發(fā)表期刊：Nature Chemistry 影響因子：IF19.2/Q1 單位：芝加哥大學(xué) 研究方法研究者采用一種N-亞硝化策略，通過羰基有機催化劑和路易斯酸催化劑的協(xié)同催化作用，實現(xiàn)對RNA中腺苷（A）的脫氨基反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤（I）。這種方法被稱為化學(xué)協(xié)同催化輔助m6A測序（chemical cooperative catalysis-assisted m6A sequencing，CAM-seq）。具體實驗步驟如下：
圖1：羰基有機催化劑和路易斯酸催化的一級胺協(xié)同脫氨基反應(yīng)。 a. 在苛刻的酸性條件下，亞硝酸鹽離子通過逐步的亞硝化和重氮化反應(yīng)介導(dǎo)脫氨基作用。 b. 本研究和GLORI-seq：由羰基有機催化劑和路易斯酸（LA）催化的協(xié)同脫氨基反應(yīng)。 c. 全轉(zhuǎn)錄組m6A測序的m6A-CAM-seq方法示意圖。RNA樣本被片段化，并在優(yōu)化的條件下進(jìn)行處理，隨后進(jìn)行純化和測序文庫制備。 研究結(jié)果（1）溫和條件下對底物進(jìn)行一般脫氨基處理研究者在溫和條件下對多種核苷酸底物進(jìn)行了脫氨基反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)甘油醛與硼酸三氟化物乙醚（BF3·OEt2）組合能高效脫氨基廣泛的核苷酸底物。通過改變羰基催化劑，從二羰基有機催化劑改為單羰基有機催化劑（如糠醛），可以顯著提高鳥苷類似物的脫氨基產(chǎn)率。研究者推測這可能是因為鳥苷類似物在位置6處可以與甘油醛環(huán)化，形成鳥苷-甘油醛加合物。
圖2：由有機催化劑與路易斯酸共同催化的核苷酸脫氨基反應(yīng)。 a-c. 以胞嘧啶（a）、腺苷（b）和鳥苷（c）及其類似物為底物的脫氨基反應(yīng)范圍。 d. 在優(yōu)化的催化條件下，對甲基化核苷進(jìn)行反應(yīng)。 （2）闡明反應(yīng)機制通過15N核磁共振（NMR）光譜學(xué)跟蹤反應(yīng)過程，研究者發(fā)現(xiàn)，在沒有路易斯酸的情況下，15N6腺苷與甘油醛的縮合反應(yīng)非常緩慢，即使在50℃下加熱2小時后，縮合產(chǎn)物的形成仍然很少。然而，加入BF3·OEt2后，15N標(biāo)記的腺苷在半小時內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為中間體Int 3。二維1H-15N HMBC光譜學(xué)被用來監(jiān)測路易斯酸催化的縮合反應(yīng)，具有更高的15N靈敏度。在Na15NO2存在的情況下，15N亞胺信號消失，表明其轉(zhuǎn)化為脂肪族硝基取代的中間體，并隨后重排為N-亞硝化加合物。這些結(jié)果證實了通過亞胺中間體的反應(yīng)路徑。
圖3：反應(yīng)機制研究與催化循環(huán)。 a.15N6腺苷脫氨基反應(yīng)的一維15N核磁共振（NMR）譜圖。 b. 提出的脫氨基反應(yīng)的催化循環(huán)。 （3）DNA和RNA中腺苷脫氨基的選擇性條件研究者進(jìn)一步探索了優(yōu)化CAM-seq選擇性條件，使其對腺苷的脫氨基反應(yīng)具有更高的選擇性。通過測試不同的路易斯酸，發(fā)現(xiàn)硼酸在提高反應(yīng)活性方面最為有效。在硼酸存在的情況下，二羰基化合物比單羰基化合物具有更高的脫氨基效率。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析，甘油醛和三氟丙醛都表現(xiàn)出對腺苷的選擇性，但由于三氟丙醛導(dǎo)致的顯著DNA/RNA降解，研究者選擇了甘油醛進(jìn)行進(jìn)一步研究。在優(yōu)化的脫氨基條件下，甘油醛在DNA和RNA中都表現(xiàn)出對腺苷的完全脫氨基反應(yīng)，而m6A位點保持不變。
圖4：在寡核苷酸中優(yōu)化脫氨基條件。 a-b.在不同路易斯酸催化劑（a）和羰基有機催化劑（b）條件下，寡核苷酸中腺苷位點的突變比率。硼酸（紅色輪廓）和甘油醛（藍(lán)色輪廓）催化劑被選中進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化（n=4）。 c.不同羰基有機催化劑對A和C脫氨基的催化效率比較。二羰基催化劑在A位點的轉(zhuǎn)化率高于C位點。 d.在優(yōu)化條件下，6堿基DNA寡核苷酸CTCAGC表現(xiàn)出對G保護(hù)和A脫氨基的高反應(yīng)性。 e.使用5堿基m6A RNA寡核苷酸探針（ACm6AGU），在與d相似條件下展示A和m6A的選擇性。 f-h. LC–MS/MS監(jiān)測DNA寡核苷酸脫氨基反應(yīng)中甘油醛（f）、硼酸（g）和亞硝酸鹽（h）濃度的優(yōu)化（n=3）。 i-k. LC–MS/MS監(jiān)測RNA寡核苷酸脫氨基反應(yīng)中甘油醛（i）、硼酸（j）和亞硝酸鹽（k）濃度的優(yōu)化（n=3）。 （4）CAM-seq m6A檢測的優(yōu)化條件研究者注意到，盡管甘油醛作為一種有機催化劑非常有效，但它傾向于與鳥苷形成加合物，這可能導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶在逆轉(zhuǎn)錄過程中停止（RT stops）。因此，研究者選擇了kethoxal作為保護(hù)基團(tuán)，因為它具有更高的反應(yīng)速率和更好的可逆性。在優(yōu)化條件下，CAM-seq能夠在接近中性的pH值下進(jìn)行，顯著減少RNA降解。通過測試11種不同的逆轉(zhuǎn)錄酶和3種不同的dNTP比例（dTTP/dCTP比例為1:1、1:40和1:400），研究者發(fā)現(xiàn)RevertAid RT在dTTP/dCTP比例為1:40時，背景噪聲水平最低，約為0.36%。
圖5：CAM-seq 協(xié)議的優(yōu)化。 a. 使用甘油醛保護(hù)的G位點的RNA寡核苷酸探針測試了逆轉(zhuǎn)錄（RT）停止情況。 b. 使用kethoxal保護(hù)的RNA寡核苷酸探針在與a相似的條件下展示了RT停止比率。 c-f. 在中性條件下，使用甘油醛（c,d）和kethoxal（e,f）對DNA寡核苷酸的籠化（caging）（c,e）和去籠化（decaging）（d,f）動態(tài)比較。 g. 在中性條件下，甘油醛對kethoxal完全籠化的DNA寡核苷酸的競爭。 h-i. 使用完整的RNA（h）和200個核苷酸片段化的RNA（i）進(jìn)行RNA降解實驗。 j. 通過插入寡核苷酸測序數(shù)據(jù)優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄酶條件。測試了11種逆轉(zhuǎn)錄酶和3種dTTP/dCTP比例（1:1、1:40和1:400）。一個突出的條件（RevertAid RT在1:40比例下）顯示出低于0.36%的背景噪聲水平。 （5）人、擬南芥、玉米等不同物種轉(zhuǎn)錄組中的m6A全面圖譜使用優(yōu)化的CAM-seq協(xié)議，研究者在人類HEK293T細(xì)胞系中鑒定了282281個高度可信的m6A位點（P＜0.001）。其中，235173個和180056個位點的修飾比例分別大于5%和10%。GAC motif最為富集，占HEK293T轉(zhuǎn)錄組中可信位點的54%，其次是AAC motif，占27%。值得注意的是，YAC（CAC/UAC）和RAU（GAU/AAU）motif，這些與RAC motif僅相差一個核苷酸的motif，也顯示出一定程度的m6A修飾。在人類轉(zhuǎn)錄組中，m6A富集的motif（如GAC）在3'-UTR區(qū)域的終止密碼子附近表現(xiàn)出明顯的富集信號，進(jìn)一步證實了CAM-seq能夠提供整個轉(zhuǎn)錄組的高質(zhì)量m6A圖譜。 研究者還對擬南芥和玉米的RNA樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)RAC motif在這些植物中也是最富集的m6A修飾motif。然而，與人類樣本不同的是，RAC motif僅占植物中所有m6A位點的40%，而在人類樣本中約為85%。此外，植物中AAC motif豐度最高，而在人類中則是GAC motif豐度最高。這些結(jié)果表明，植物中的m6A修飾模式與人類存在差異，可能與植物中m6A修飾的調(diào)控機制有關(guān)。
圖6：m6A修飾的精確定量揭示了在motif水平上的m6A沉積。 a. 所有A位點（覆蓋度＞20）的m6A修飾水平分布，以GAC和UAG motif為例。 b. 多種方法檢測到的m6A位點與估計背景噪聲的比較。 c. CAM-seq和GLORI-seq在126362個重疊位點上m6A水平的相關(guān)性（r=0.883）。紅色虛線表示相等水平。紅色三角形標(biāo)記的區(qū)域突出了GLORI-seq高估m(xù)6A水平的位點。 d. 在三種基于脫氨基的方法中觀察到的所有m6A位點中，AAC motif的比例，計算為所有位點的（m6A比率×覆蓋率）之和與所有位點的（m6A比率×覆蓋率）之和的比值。 e. 人類樣本中所有A位點（無過濾）的平均甲基化水平與相對motif頻率的關(guān)系。GAC和AAC motif（紅色）高于背景水平。整體m6A水平表示為0.41%。 f-g. 擬南芥（f）和玉米（g）中所有A位點的平均甲基化水平與相對motif頻率的關(guān)系。整體m6A水平分別表示為0.77%和0.69%。 h. 人類、擬南芥和玉米中通過過濾的16 three-letter motif的頻率與平均甲基化水平之間的關(guān)系。 i-k. 人（i）、擬南芥（j）和玉米（k）中相對于m6A位點的每個位置核苷酸重要性評分。 （6）飽和分析將轉(zhuǎn)錄速率與m6A水平關(guān)聯(lián)分析研究者通過飽和m6A圖譜分析發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)水平與平均m6A水平呈負(fù)相關(guān)。具體來說，高轉(zhuǎn)錄率基因傾向于具有較低m6A水平，可能是由于m6A沉積復(fù)合物的可用性有限，或者甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物與轉(zhuǎn)錄機制在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)關(guān)聯(lián)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，基因的最大m6A修飾水平可以作為區(qū)分基因的一個重要參數(shù)。將基因分為兩組：一組是所有m6A位點的修飾水平普遍較低的基因，另一組是具有高修飾潛力的基因。這兩組基因的表達(dá)水平與m6A水平都呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)性。
圖7：影響m6A變化的因子。 a. 插圖展示了A位點的區(qū)域和基因分布如何影響基因中m6A修飾水平的變異。 b. 基于meta基因分析，終止密碼子附近的-20到+180核苷酸區(qū)域被確定為m6A沉積的熱點區(qū)域。 c. 基因間和單個基因內(nèi)的變異對應(yīng)數(shù)據(jù)。 d. log10基因表達(dá)水平與平均m6A水平之間的關(guān)系，以等高線圖表示，并帶有虛線趨勢線。 e. 所有基因的最大m6A修飾水平分布。低甲基化和高甲基化組的擬合曲線分別用藍(lán)色和紅色虛線標(biāo)記。 f. 基因內(nèi)平均m6A修飾水平與最大m6A修飾水平之間的相關(guān)性。 g-h. 僅低修飾基因（g）和僅高修飾基因（h）的log10基因表達(dá)水平與平均m6A水平之間的關(guān)系。 i. 所有基因（黑色）、無m6A修飾基因（藍(lán)色）、低m6A修飾基因（黃色）和高m6A修飾基因（紅色）的m6A水平與基因表達(dá)之間的總體關(guān)系。 CAM-seq、NO-seq、NT-seq、GLORI、MeRIP-seq等m6A測序方法介紹及比較（1）CAM-seq（化學(xué)協(xié)同催化輔助的m6A測序）原理：通過化學(xué)協(xié)同催化策略，利用羰基催化劑和路易斯酸催化劑的協(xié)同作用，將RNA中的腺苷（A）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤（I），而m6A位點抵抗脫氨基反應(yīng)，保持為腺苷。通過逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶讀取時，I被讀作鳥嘌呤（G），從而實現(xiàn)m6A檢測。 優(yōu)點： 溫和條件：反應(yīng)在接近中性的pH值下進(jìn)行，避免了RNA降解。 低背景噪聲：背景噪聲低至0.5%，遠(yuǎn)低于其他方法。 低輸入量：僅需10ng的RNA輸入即可實現(xiàn)高分辨率檢測。 高靈敏度：能夠檢測到低比例的m6A修飾位點。 應(yīng)用場景： 適用于低輸入量的RNA樣本，如單細(xì)胞RNA測序、微量組織樣本等。 （2）NO-seq（硝酸鹽介導(dǎo)的m6A測序）原理：通過硝酸鹽離子介導(dǎo)的化學(xué)脫氨基反應(yīng)，將RNA中的腺苷（A）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤（I），從而實現(xiàn)m6A的檢測。 優(yōu)點： 操作簡單：不需要復(fù)雜的酶反應(yīng)步驟。 成本低：試劑成本較低。 缺點： 反應(yīng)條件苛刻：需要在酸性條件下進(jìn)行，可能導(dǎo)致RNA降解。 背景噪聲高：由于反應(yīng)不完全，背景噪聲較高，影響檢測準(zhǔn)確性。 （3）NT-seq（硝酸鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組測序）原理：與NO-seq類似，通過硝酸鹽離子介導(dǎo)的化學(xué)脫氨基反應(yīng)，將RNA中的腺苷（A）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤（I），從而實現(xiàn)m6A的檢測。 優(yōu)點： 操作簡單：不需要復(fù)雜的酶反應(yīng)步驟。 成本低：試劑成本較低。 缺點： 反應(yīng)條件苛刻：需要在酸性條件下進(jìn)行，可能導(dǎo)致RNA降解。 背景噪聲高：由于反應(yīng)不完全，背景噪聲較高，影響檢測準(zhǔn)確性。 （4）GLORI（化學(xué)保護(hù)基團(tuán)介導(dǎo)的m6A測序）原理：通過化學(xué)保護(hù)基團(tuán)（如甘油醛）保護(hù)鳥苷（G），然后進(jìn)行化學(xué)脫氨基反應(yīng)，將RNA中的腺苷（A）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤（I），從而實現(xiàn)m6A的檢測。 優(yōu)點： 選擇性高：通過保護(hù)基團(tuán)的選擇性保護(hù)，提高了脫氨基反應(yīng)的選擇性。 高靈敏度：能夠檢測到低比例的m6A修飾位點。 缺點： 反應(yīng)條件苛刻：需要在酸性條件下進(jìn)行，可能導(dǎo)致RNA降解。 背景噪聲高：由于保護(hù)基團(tuán)的不完全去除，可能導(dǎo)致背景噪聲較高。 高輸入量：需要較多的RNA輸入量（通常為微克級別）。 （5）MeRIP-seq（m6A免疫沉淀測序）原理：通過特異性的m6A抗體對RNA進(jìn)行免疫沉淀，然后通過高通量測序檢測m6A修飾位點。 優(yōu)點： 全轉(zhuǎn)錄組：能夠?qū)崿F(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組的m6A檢測。 廣泛適用：適用于多種類型的RNA樣本。 缺點： 高輸入量：需要較多的RNA輸入量（通常為微克級別）。 背景噪聲高：由于抗體的非特異性結(jié)合，可能導(dǎo)致背景噪聲較高。 操作復(fù)雜：需要進(jìn)行免疫沉淀步驟，操作較為復(fù)雜。 #基礎(chǔ)技術(shù)方法論專題 #m6A專題 關(guān)于易基因RNA m6A甲基化測序(MeRIP-seq)技術(shù)易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測序，可以對RNA上的m6A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測。 大樣本量m6A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個樣品價格高，通常難以承擔(dān)。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實現(xiàn)不同樣本間相對定量，降低檢測成本。 易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：
技術(shù)優(yōu)勢：
研究方向： m6A甲基化目前主要運用在分子機制的理論性研究
關(guān)于m6A甲基化研究思路 （1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數(shù)量變化、m6A修飾基因數(shù)量變化、單個基因m6A peak數(shù)量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析 （2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時序數(shù)據(jù)的分析策略、時序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示 （3）m6A甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析：Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對應(yīng)關(guān)聯(lián)、m6A修飾目標(biāo)基因的篩選策略 （4）進(jìn)一步驗證或后期試驗
易基因提供全面的表觀基因組學(xué)（DNA甲基化、DNA羥甲基化、cfDNA）和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA與蛋白互作）、DNA與蛋白互作及染色質(zhì)開放性技術(shù)方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。
參考文獻(xiàn)： Wang, P., Ye, C., Zhao, M. et al. Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA. Nat. Chem. (2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01801-3 相關(guān)閱讀： 1、2024項目文章精選：DNA甲基化、RNA甲基化（m6A/m5C）、ChIP-seq、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、宏基因組｜年終盤點 2、項目文章 | Adv Sci：NSUN2介導(dǎo)m5C修飾代謝重編程促進(jìn)腫瘤進(jìn)展 揭示治療新選擇 3、項目文章 | NAR：RCMS編輯系統(tǒng)在特定細(xì)胞RNA位點的靶向m5C甲基化和去甲基化研究 4、項目文章：MeRIP-seq+RNA-seq揭示不同品種豬肌肉發(fā)育的m6A RNA甲基化差異|育種研究 5、項目文章：MeRIP-seq+RNA-seq揭示家禽(雞)脂肪沉積中的m6A RNA甲基化調(diào)控機制 6、項目文章 | MeRIP-seq揭示m6A修飾在肺動脈高壓(PAH)發(fā)病機制中的潛在作用和新治療靶點 7、項目文章 | 90天見刊，易基因m6A RNA甲基化(MeRIP)+轉(zhuǎn)錄組組學(xué)研究 8、項目集錦 | 易基因近期m6A甲基化（MeRIP-seq）研究成果 10、m6A/m5C/m1A/m7G/ac4C/Ψ等8種RNA修飾的生物學(xué)功能和潛在機制 | 深度綜述 11、深度綜述：癌癥中RNA修飾機制的遺傳和表觀遺傳失調(diào)（m6A+m1A+m5C+ψ） |
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