引用本文：羅玉, 吳城荔, 胡勇, 等. 帕金森病及多系統(tǒng)萎縮患者血漿增強(qiáng)α-突觸核蛋白聚集體對細(xì)胞線粒體及溶酶體功能的影響[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2024, 23(12): 1195-1204. DOI: 10.3760/cma.j.cn115354-20240814-00484.

作者：羅玉    吳城荔    胡勇    陳敏    羅漢將

作者單位：廣西神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

摘    要

目的    觀察帕金森病(PD)及多系統(tǒng)萎縮(MSA)患者血漿孵育形成的α-突觸核蛋白(α-Syn)聚集體對細(xì)胞線粒體及溶酶體功能的影響，以進(jìn)一步明確α-Syn在PD及MSA病理機(jī)制中的作用。

方法    將10 μg/mL經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)及健康對照者(HC)、PD患者、MSA患者血漿孵育后形成的α-Syn聚集體分別處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y(分別為PBS組、HC組、PD組、MSA組)，以未經(jīng)處理的SH-SY5Y細(xì)胞為對照組。采用線粒體紅色熒光探針熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位，Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測線粒體及細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(Cyt C)的表達(dá)，三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平，從而評價不同α-Syn聚集體對細(xì)胞線粒體功能的影響。采用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞中溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白1(LAMP1)的表達(dá)，魔力紅熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測溶酶體中組織蛋白酶B活性，從而評價不同α-Syn聚集體對細(xì)胞溶酶體功能的影響。

結(jié)果    (1)不同α-Syn聚集體對線粒體功能的影響：與對照組相比，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體紅色熒光探針熒光染色相對強(qiáng)度明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體紅色熒光探針熒光染色相對強(qiáng)度明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組(60.05%±4.24%)相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體紅色熒光探針熒光染色相對強(qiáng)度(41.27%±5.97%)明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)明顯降低，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05）；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組(線粒體Cyt C蛋白：65.52%±2.18%，細(xì)胞漿Cyt C蛋白：174.00%±16.18%)相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白(51.50%±4.22%)表達(dá)明顯降低，細(xì)胞漿中Cyt C蛋白(199.40%±6.73%)表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組[(2.96±0.29) nmol/mg]相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP水平[(1.81±0.13) nmol/mg]明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05）。(2)不同α-Syn聚集體對溶酶體功能的影響：與對照組相比，PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞中LAMP1蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組、HC組及PD組(79.70%±4.34%)相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞中LAMP1蛋白(60.74%±7.94%)表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體中組織蛋白酶B魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05）；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體中組織蛋白酶B魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組(305.90%±24.87%)相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體中組織蛋白酶B魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度(399.00%±35.54%)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)論    PD患者和MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體均可嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞線粒體及溶酶體功能，尤以后者為著。

前   言

帕金森病(Parkinson's disease，PD)和多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy，MSA)均是臨床常見的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)病。但在臨床上，PD和MSA表現(xiàn)出不同的進(jìn)展速度，PD進(jìn)展相對緩慢，平均病程在20年以上，MSA進(jìn)展相對迅速，平均病程不到10年；在病理上，PD的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)是α-Syn在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)異常聚集形成路易小體(Lewy bodies，LBs)，MSA的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)是α-Syn在膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)形成膠質(zhì)胞漿包涵體(glial cytoplasmic inclusions，GCIs)^[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，與LBs相比，GCIs對蛋白酶K具有更強(qiáng)的抵抗力，且GCIs來源的α-Syn可造成小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的神經(jīng)病理改變，提示不同α-Syn病的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性存在差異，PD及MSA中α-Syn可能具有不同的蛋白構(gòu)象，從而導(dǎo)致兩者臨床進(jìn)展存在明顯差異^[3-4]。

研究顯示，α-Syn可在體內(nèi)外進(jìn)行自組裝并聚集，形成的聚集體可以“種子”的形式，發(fā)生類似朊病毒樣的播散，其構(gòu)象狀態(tài)受pH、溫度、離子強(qiáng)度和黏度等影響^[5]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，與正常血漿相比，PD患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體對蛋白酶K及胰蛋白酶的抵抗能力明顯較強(qiáng)，表明PD血漿環(huán)境影響了α-Syn聚集體的結(jié)構(gòu)，使其具有更高的穩(wěn)定性^[6]。此外，PD相關(guān)研究結(jié)果顯示，α-Syn聚集體的神經(jīng)毒性與其對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)通透性損傷及其在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，并通過進(jìn)一步造成線粒體、溶酶體和高爾基體等細(xì)胞器膜損傷而導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷^[7-11]。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，與PD患者血漿相比，MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體對人工質(zhì)膜和細(xì)胞膜的破壞作用存在明顯差異^[12]。那么，MSA與PD的疾病進(jìn)展差異是否還可能與不同環(huán)境下形成的α-Syn聚集體所致的細(xì)胞及細(xì)胞器功能損傷差異有關(guān)呢？然而，目前關(guān)于MSA患者中α-Syn聚集體所致細(xì)胞功能損傷的研究較少，且其與PD患者中α-Syn聚集體的作用差異尚不明確。

本研究在制備磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、健康對照者(healthy controls，HC)血漿、PD患者血漿及MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體基礎(chǔ)上，比較了不同α-Syn聚集體對細(xì)胞線粒體和溶酶體功能影響的差異，以期為闡明造成PD和MSA臨床進(jìn)展差異的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 血漿來源：PD患者、MSA患者及HC(各6例)血漿收集自桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科自2018年1月至2022年1月收治患者及健康體檢人員。其中，6例PD患者(男性3例、女性3例)均符合國際運(yùn)動障礙疾病協(xié)會帕金森病診斷新標(biāo)準(zhǔn)(2015)^[13]，年齡為(63.00±6.03)歲，病程為(1.31±0.54)年；6例MSA患者(男性3例、女性3例）為MSA-P亞型，均符合2008年Gilman等^[14]對MSA修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡為(61.33±3.78)歲，病程為(1.44±0.75）年；6例HC(男性3例、女性3例）為同時期接受體檢且年齡、性別與PD患者、MSA患者匹配的健康人員，年齡為(61.17±6.77)歲。PD患者、MSA患者及HC間年齡的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.192，P=0.827)。PD患者與MSA患者間病程的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.368，P=0.721)。本研究獲得桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：2022YJSLL-127)，所有受試者均簽訂知情同意書。

2. 細(xì)胞及主要試劑：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，重組人源α-Syn蛋白(加拿大StressMarq公司)，兔抗細(xì)胞色素C (cytochrome C，Cyt C)單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白1 (lysosomal associated membrane protein-1，LAMP1)多克隆抗體(美國CST公司)，兔抗α-Syn抗體、小鼠抗電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1 (voltage dependent anion channel 1，VDAC1)抗體(英國Abcam公司)，小鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司)，山羊抗小鼠/兔IgG熒光二抗(美國LICOR公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胎牛血清(美國Gibco公司)，線粒體紅色熒光探針染色液、Hoechst 33342染色液(細(xì)胞核染料）、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，培養(yǎng)細(xì)胞線粒體分離試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientifc公司)，RIPA裂解液、脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司），組織蛋白酶B檢測試劑盒(魔力紅染色液)(英國Abcam公司），硝酸纖維素膜(美國PALL公司)。

3. 主要儀器：電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)，ODYSSEY雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)，恒溫振蕩混勻儀(美國Thermo Fisher Scientifc公司)，酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 不同α-Syn聚集體的制備及鑒定：將重組人源α-Syn蛋白分別與PBS、PD患者、MSA患者及HC血漿混勻，使α-Syn終濃度為2 mg/mL，37 ℃條件下1 800×g離心恒溫振蕩孵育4 d。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白樣品濃度測定。各取200 ng蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉90 min；加入兔抗α-Syn抗體(稀釋比1∶10 000)于4 ℃條件下孵育過夜，洗膜緩沖液漂洗5次后，于室溫條件下加入山羊抗兔熒光二抗(稀釋比1∶10 000)孵育1 h；洗膜緩沖液漂洗5次后，于ODYSSEY雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像，利用Image J 1.53軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，并對各組間總蛋白中α-Syn聚集體(相對分子質(zhì)量>35 000)水平進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：按1×10⁴個/孔密度接種SH-SY5Y細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，或按40%匯合度接種于6孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板或10 cm細(xì)胞培養(yǎng)板，使用包含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以未經(jīng)處理的SH-SY5Y細(xì)胞為對照組，以分別添加10 μg/mL PBS、HC血漿、PD患者血漿及MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體的SH-SY5Y細(xì)胞為PBS組、HC組、PD組、MSA組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

3. 線粒體膜電位檢測：檢測方式參考本課題組既往研究報道^[15]，簡述如下：吸除上述各組SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基，并使用PBS清洗1次，加入96.5 μL反應(yīng)結(jié)合液、1 μL線粒體紅色熒光探針染色液以及2.5 μL Hoechst 33342染色液，輕輕混勻后置于室溫條件下避光孵育30 min，于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞成像，計算各組細(xì)胞熒光染色相對強(qiáng)度(以對照組熒光染色強(qiáng)度為參照進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化)并進(jìn)行組間差異比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

4. ATP水平檢測：利用ATP檢測試劑盒中螢火蟲螢光素酶催化產(chǎn)生熒光與所需ATP含量呈正比原理，檢測各組細(xì)胞內(nèi)ATP水平，具體操作簡述如下：吸除上述各組SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗1次后加入裂解液裂解細(xì)胞，于4 ℃條件下12 000×g離心5 min，吸取上清液用于測定。以BCA蛋白定量試劑盒檢測各蛋白樣品濃度，并將100 μL ATP檢測工作液加入檢測管內(nèi)，室溫放置3~5 min后向檢測管內(nèi)加上20 μL樣品，迅速混勻，于酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光模式下進(jìn)行測定，以各組蛋白濃度作為校準(zhǔn)進(jìn)行組間差異比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

5. Cyt C、LAMP1蛋白表達(dá)檢測：收集10 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中上述各組SH-SY5Y細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞線粒體分離試劑盒的操作說明步驟，分離線粒體和細(xì)胞漿組分蛋白。同時收集6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中上述各組SH-SY5Y細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞30 min，于4 ℃條件下12 000×g離心30 min，收集上清(即為細(xì)胞總蛋白)，并采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白樣品濃度測定。各取20 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉90 min；分別加入兔抗Cyt C單克隆抗體(稀釋比1∶1 000)、兔抗LAMP1多克隆抗體(稀釋比1∶1 000)、小鼠抗VDAC1抗體(稀釋比1∶5 000)、小鼠抗β-actin抗體(稀釋比1∶5 000)于4 ℃條件下孵育過夜；洗膜緩沖液漂洗5次后，于室溫條件下孵育山羊抗小鼠/兔IgG熒光二抗(稀釋比1∶ 10 000) 1 h，洗膜緩沖液漂洗5次后，于ODYSSEY雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像，利用Image J 1.53軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，以VDAC1條帶灰度值作為線粒體蛋白內(nèi)參校準(zhǔn)，以β-actin條帶灰度值作為細(xì)胞漿蛋白內(nèi)參校準(zhǔn)，并以對照組Cyt C、LAMP1蛋白相對表達(dá)水平為參照進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

6. 組織蛋白酶B活性檢測：利用組織蛋白酶B檢測試劑盒檢測溶酶體中組織蛋白酶B活性，具體操作簡述如下：吸除上述各組SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基，使用PBS清洗1次后更換為新鮮培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入約1/25體積的魔力紅染色液，輕輕混合后于37 ℃條件下避光孵育1 h，PBS漂洗2次、1 min/次。按0.5%體積分?jǐn)?shù)添加Hoechst 33342染色液，37 ℃條件下孵育20 min，PBS漂洗2次、1 min/次。于倒置熒光顯微鏡下拍照成像，利用Image J 1.53軟件進(jìn)行熒光染色強(qiáng)度掃描，計算各組細(xì)胞內(nèi)魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度(以對照組熒光染色強(qiáng)度為參照進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化)并進(jìn)行組間差異比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖。呈近似正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey's檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)        果

一、不同α-Syn聚集體水平差異

重組人源α-Syn單體蛋白經(jīng)PBS、HC血漿、PD患者血漿及MSA患者血漿振蕩孵育后分別形成不同的聚集體：PBS組α-Syn聚集體主要為相對分子質(zhì)量約為36 000的二聚體(單體蛋白的相對分子質(zhì)量約為18 000)，其余各組α-Syn聚集體除形成二聚體外，還形成了四聚體(聚集體蛋白的相對分子質(zhì)量約為72 000)、五聚體(聚集體蛋白的相對分子質(zhì)量約為90 000)及更高相對分子質(zhì)量的聚集體。4組α-Syn聚集體水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.610，P<0.001)，其中與PBS組(100.00±11.75)及HC組(83.75±2.04)相比，PD組和MSA組α-Syn聚集體水平明顯增加(208.30±30.11、383.90±75.92)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組相比，MSA組α-Syn聚集體水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體內(nèi)容見圖1。

二、不同α-Syn聚集體對線粒體膜結(jié)構(gòu)及功能的破壞作用

倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞成像顯示，與對照組相比，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體紅色熒光探針熒光染色相對強(qiáng)度明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體紅色熒光探針熒光染色相對強(qiáng)度明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體紅色熒光探針熒光染色相對強(qiáng)度明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體內(nèi)容見圖2、表1。

Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)明顯降低，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體內(nèi)容見圖3、表1。

ATP檢測實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體內(nèi)容見表1。

三、不同α-Syn聚集體對溶酶體膜結(jié)構(gòu)及功能的破壞作用

Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞中LAMP1蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組、HC組及PD組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞中LAMP1蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體內(nèi)容見圖4、表1。

倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞成像顯示，與對照組相比，PBS組、HC組、PD組及MSA組SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體中組織蛋白酶B魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PBS組和HC組相比，PD組和MSA組SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體中組織蛋白酶B魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PD組相比，MSA組SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體組織中蛋白酶B魔力紅熒光染色相對強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體內(nèi)容見表1、圖5。

討        論

既往研究顯示，與PD來源的α-Syn聚集體相比，MSA來源的α-Syn聚集體神經(jīng)毒性更強(qiáng)，這可能與后者具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及其對細(xì)胞的損傷作用更大有關(guān)^[3-4]。α-Syn聚集體與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相互作用參與著PD中的神經(jīng)元死亡。研究顯示α-Syn與脂膜如細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜等的結(jié)合被認(rèn)為是α-Syn聚集的關(guān)鍵觸發(fā)點(diǎn)，一方面這些脂膜可以促進(jìn)α-Syn聚集，另一方面α-Syn聚集時中間體可導(dǎo)致脂膜通透性改變，從而改變其完整性^[16-18]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD患者和MSA患者血漿孵育的α-Syn聚集體對細(xì)胞膜的損傷作用不同，MSA患者血漿孵育的α-Syn聚集體的聚集程度更高并具有更強(qiáng)的破壞細(xì)胞膜和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡能力^[12]。細(xì)胞膜是維持細(xì)胞完整性的結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞器(如線粒體和溶酶體等)是細(xì)胞發(fā)揮生理功能的結(jié)構(gòu)，那么，PD和MSA來源的α-Syn聚集體是否對細(xì)胞器膜存在不同的損傷作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)功能差異呢？

線粒體膜電位是評估線粒體結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)，而線粒體紅色熒光探針可以通過對細(xì)胞中的線粒體進(jìn)行特異性染色來評估線粒體膜結(jié)構(gòu)的損傷程度(活性線粒體染色時會發(fā)出明亮的紅色熒光，而當(dāng)細(xì)胞損傷時，線粒體膜電位下降，線粒體的紅色熒光會逐漸減弱甚至消失)。在活性線粒體中，Cyt C作為電子傳遞鏈中的電子載體，可促進(jìn)ATP合成，調(diào)節(jié)心磷脂過氧化，影響活性氧的動力學(xué)；而當(dāng)線粒體損傷時，線粒體膜通透性發(fā)生改變，Cyt C則會從線粒體中釋放到細(xì)胞漿中^[19]。因此，本研究利用Western blotting方法分別檢測線粒體及細(xì)胞漿中Cyt C的表達(dá)，以評估線粒體功能的損傷情況。此外，產(chǎn)生ATP以維持細(xì)胞代謝是線粒體的主要功能之一，ATP水平下降則表明線粒體功能受損。因此，利用ATP檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平也可以評估線粒體功能的損傷情況。本研究發(fā)現(xiàn)，不同條件孵育形成的α-Syn聚集體均可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位降低，ATP生成減少，Cyt C蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞漿增加，提示著細(xì)胞線粒體膜及線粒體功能出現(xiàn)了明顯損傷，其中PD和MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體對線粒體膜及線粒體功能具有更大的損傷作用，且以后者為著。

關(guān)于PD中溶酶體損傷的研究結(jié)果顯示，α-Syn原纖維可通過胞飲方式迅速進(jìn)入到溶酶體，并引起大的晚期溶酶體在細(xì)胞內(nèi)積聚，通過改變?nèi)苊阁w的形狀和膜滲透性，損害溶酶體的降解功能，同時誘導(dǎo)α-Syn原纖維在溶酶體的外周重新分布，提高α-Syn原纖維轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞的效率，促進(jìn)PD病理結(jié)構(gòu)的傳播^[20-22]。LAMP1是一種主要存在于溶酶體膜上的高度糖基化的糖蛋白，是溶酶體糖萼的組成部分，可保護(hù)溶酶體膜的管腔側(cè)免受溶酶體酶和低pH條件的降解^[23]。其作為溶酶體標(biāo)記蛋白參與著溶酶體功能的維持，在維持溶酶體結(jié)構(gòu)完整性、溶酶體pH調(diào)節(jié)、自噬和分解代謝等多個方面發(fā)揮著重要作用，是溶酶體完整性所必需的^[24-25]。溶酶體膜通透化是溶酶體膜損傷引起的溶酶體內(nèi)組織蛋白酶和水解酶外泄的過程。溶酶體膜通透性通常與LAMP1的減少以及溶酶體組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和D)釋放相關(guān)^[26]。利用組織蛋白酶水解魔力紅而導(dǎo)致熒光信號改變的特點(diǎn)，魔力紅染色常用來反應(yīng)溶酶體功能的損傷情況，即當(dāng)溶酶體損傷時，組織蛋白酶B活性增強(qiáng)，魔力紅底物被裂解，甲酰紫熒光團(tuán)在激發(fā)時變?yōu)闊晒獠⑿盘栐鰪?qiáng)^[27]。因此，可以利用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測LAMP1蛋白的表達(dá)以評估溶酶體膜的損傷情況，利用魔力紅檢測組織蛋白酶B的活性以評估溶酶體功能的損傷情況。本研究發(fā)現(xiàn)，不同條件孵育形成的α-Syn聚集體均可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP1表達(dá)明顯下降，組織蛋白酶B釋放及活性明顯增加，提示著溶酶體膜及溶酶體功能發(fā)生明顯損傷，其中PD和MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體對溶酶體膜及溶酶體功能具有更明顯的損傷作用，且以后者為著。

與PD相比，MSA的臨床特點(diǎn)是病程進(jìn)展快，預(yù)后較差，平均預(yù)期壽命更短。而造成二者臨床進(jìn)展差異的病理原因可能是PD和MSA中關(guān)鍵致病蛋白α-Syn及其聚集體的神經(jīng)毒性作用及傳播特性存在差異。既往研究顯示，α-Syn聚集體的形成與特定的細(xì)胞微環(huán)境條件有關(guān)^[28]。與PBS中形成的α-Syn聚集體相比，PD患者血漿代謝環(huán)境能促進(jìn)α-Syn聚集體形成，并具有更大的細(xì)胞毒性^[29-30]。而MSA患者具有著不同于PD患者的血漿代謝環(huán)境，可能會導(dǎo)致α-Syn聚集體產(chǎn)生更大的神經(jīng)毒性。本研究結(jié)果表明，α-Syn聚集體可通過破壞細(xì)胞器從而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，且不同患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體引起的神經(jīng)毒性差異是由于其與細(xì)胞器結(jié)合或破壞能力不同造成的。本研究結(jié)果為解釋PD與MSA二者臨床進(jìn)展差異的機(jī)制提供了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，造成不同來源α-Syn聚集體神經(jīng)毒性及傳播特性不同的原因還可能與它們不同的結(jié)構(gòu)及修飾差異有關(guān)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組將繼續(xù)探究PD與MSA患者血漿孵育形成的α-Syn聚集體的化學(xué)修飾情況及構(gòu)象的異同，以進(jìn)一步闡明造成PD與MSA中細(xì)胞器功能損傷及神經(jīng)毒性損傷差異的原因及潛在機(jī)制。

參考文獻(xiàn)略

  

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排版：周穗莉

校對：凌桂芳

審核：王志娟