選購(gòu)之前客戶需要根據(jù)待標(biāo)記物的分子量大小和標(biāo)記量選擇最適宜的型號(hào)

產(chǎn)品介紹：

本生物素快速標(biāo)記試劑盒提供了生物素快速標(biāo)記所需全部試劑，用于含有伯氨基（NH2-）的蛋白/抗體/多肽或者其他大分子的標(biāo)記。其反應(yīng)原理如下:

產(chǎn)品特點(diǎn)：

l   使用方法簡(jiǎn)單，無(wú)需額外準(zhǔn)備試劑；

l   節(jié)約時(shí)間，整個(gè)過(guò)程僅需 90min；

l   通過(guò)離心脫鹽和去除游離的生物素，無(wú)需透析或者凝膠過(guò)濾；

l   既可用于微量標(biāo)記又可大量標(biāo)記，每次可標(biāo)記 0.2-2mg；

l   本試劑盒對(duì)于標(biāo)記好的分子可以測(cè)試生物素標(biāo)記效率，避免額外購(gòu)買(mǎi)標(biāo)記效率檢測(cè)試劑盒

生物素標(biāo)記使用量的計(jì)算：

每個(gè)反應(yīng)中生物素試劑的使用量取決于待標(biāo)記蛋白質(zhì)的量和濃度。例如，通過(guò)我們實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，標(biāo)記2mg/ml 的抗體（IgG ，150KD），使用生物素和抗體的分子比為 20:1 能達(dá)到最佳效果；其他蛋白的標(biāo)記可以根據(jù)實(shí)際情況，參照此比例類推。

計(jì)算公式如下：

其中：

V(μL)為生物素的體積；                           V1(mL)為待標(biāo)記物（蛋白/抗體/其他含有伯胺-NH2的大分子）；

   C1(mg/mL)為待標(biāo)記物的濃度；                    R 為生物素與待標(biāo)記物的分子比例；

   M為待標(biāo)記物的分子量（道爾頓，Dalton，Da）      C(mM)為生物素的濃度

計(jì)算示例：我們將生物素配置成10mM的濃度，用來(lái)標(biāo)記1mL的2mg/mL 的抗體（IgG ，150KD），準(zhǔn)備加入的生物素與抗體的比例為20:1，那么帶入公式計(jì)算

⁶=26.66uL

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1.按照生物素標(biāo)記使用量的計(jì)算的公式計(jì)算所需要的生物素的量。

2.提前 20min 從冰箱中取出試劑盒，使試劑盒各組分平衡至室溫。

3.用助溶劑DMSO將活性生物素配制成10mM(2mg生物素加DMSO 440ul)。

 特別提示：

A.溶解的活性生物素建議一次性使用完，如使用不完可以密封放在-20℃的冰箱內(nèi)，一月內(nèi)可以使用，但是標(biāo)記效率會(huì)降低；

B.生物素助溶劑使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。

操作步驟：（本操作步驟按照 1mg抗體的量進(jìn)行標(biāo)記）

1.   取1mg 待標(biāo)記抗體于超濾管中，并加入相應(yīng)體積的標(biāo)記緩沖液，使抗體的終濃度為 2mg/mL，12,000 x g 離心 10min。

請(qǐng)注意：

A.超濾管的最大體積和最大截留分子量，本實(shí)例超濾管的最大體積為 0.5mL；

B.如果待標(biāo)記抗體濃度低時(shí)，可先超濾離心濃縮；

C.如果待標(biāo)記物含有游離的氨基（Tris,氨基酸或者其他干擾物，需要用標(biāo)記緩沖液反復(fù)超濾確保其去除干凈）

2. 加入13.3μL生物素溶液和適量標(biāo)記緩沖液至上述超濾管中，使終體積為 0.5ml，并輕輕吹打混勻。放入 37℃恒溫箱中避光溫育 30min。

3. 12,000 x g 離心 10min。

4. 加入適量標(biāo)記緩沖液至上述超濾管中，并輕輕吹打混勻，12,000 x g 離心 10min， 重復(fù)此步驟多次。

5. 收集超濾管中的溶液（即生物素標(biāo)記的抗體），加入等體積保存液，-20℃保存。

生物素標(biāo)記的抗體測(cè)量標(biāo)記效率（微孔酶標(biāo)板法）：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值，記錄為A_500(H-A);最好測(cè)量三次取平均值；

B.       在微孔板中加入20uL待測(cè)的生物素標(biāo)記蛋白（Biotinylated Protein,簡(jiǎn)稱BP），震蕩或移液器吹打充分混勻后，在500nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值，吸光值穩(wěn)定20秒以上，記錄為A_500(H-A-BP);最好測(cè)量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),請(qǐng)用PBS稀釋待測(cè)樣品，再次重復(fù)此步驟。

標(biāo)記效率計(jì)算方法：

1）蛋白摩爾濃度計(jì)算：mM /mL

2）生物素摩爾濃度計(jì)算（微孔板法）：mM /mL

其中吸光值變化(微孔酶標(biāo)板)：ΔA₅₀₀=A_500(H-A)- A_500(H-A-BP)

備注：使用標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板，200ul液體，其液面高度（光程）為0.58cm

4）標(biāo)記摩爾比計(jì)算：

生物素：蛋白=[(生物素摩爾濃度*10)/蛋白原始摩爾濃度]*稀釋倍數(shù)

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒也可標(biāo)記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體標(biāo)記比例根據(jù)待標(biāo)記物中氨基的數(shù)量確定。

2. 本試劑盒中的生物素助溶劑為DMSO ，使用完畢后要密封干燥保存。

3. 本試劑盒未開(kāi)封前的有效期為18個(gè)月，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用;本試劑盒中的生物素加入助溶劑之后，如果使用不完，請(qǐng)密封放在-20℃保存，一周內(nèi)可以正常使用，如果超過(guò)一周，一個(gè)月之內(nèi)使用，使用里量請(qǐng)酌情加大；超過(guò)一個(gè)月請(qǐng)不要再使用。

4. 請(qǐng)注意試劑盒中提供的超濾管的規(guī)格和分子截流大小來(lái)確定是否適合您的最佳標(biāo)記條件；

5. 在步驟 2 中，標(biāo)記其它抗體時(shí)，我們最好控制抗體的終濃度為 2mg/mL，然后再根據(jù)抗體的量計(jì)算應(yīng)加入活性生物素的體積。

*本試劑僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用