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一、Frdbio–SH介導(dǎo)多肽與載體偶聯(lián) 1. cKLH載體蛋白與sulfo-SMCC的偶聯(lián) （以偶聯(lián)20mg多肽為例，根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際偶聯(lián)量，所有試劑體積作同比縮放） 1.1 稱取20mg cKLH（Frdbio，Cat No.: BCJ0002），溶于2ml超純水，配成【10 mg/ml cKLH溶液】。 1.2 稱取10 mg Sulfo-SMCC(Frdbio)于2ml超純水配成【5mg/ml Sulfo-SMCC溶液】。 1.3 將以上兩種溶液等體積混勻，室溫(25℃)反應(yīng)60 min或者37℃反應(yīng)30 min，磁力攪拌器慢速均勻攪動(dòng)反應(yīng)，避免產(chǎn)生氣泡。 1.4 反應(yīng)完后將以上反應(yīng)溶液裝入10kD透析袋，在PBS（pH7.2）溶液中透析除去過多Sulfo-SMCC，每隔3h換液，至少換3～4次，確保透析完全，即為【活化的cKLH載體】（有條件的也可以用sephdex-G25分子篩色譜分離或超濾管。活化的cKLH要盡快使用，不可久放。） 2. 多肽的偶聯(lián) 偶聯(lián)前需檢測多肽中-SH活性。 2.1 Ellman試劑法檢測多肽-SH狀態(tài): 方法：在96孔酶標(biāo)板中，10μl多肽+100μl Ellman試劑，用分光光度計(jì)在96孔酶標(biāo)板中412nm進(jìn)行測量， OD＞0.15時(shí)，多肽SH正常，如果OD＜0.15，說明多肽被氧化或者自我交聯(lián)，不可使用。偶聯(lián)完成之后，透析前用上述同樣方法檢測DO＜0.03時(shí)，說明多肽已經(jīng)80%以上全部偶聯(lián)，可繼續(xù)添加多肽；如果OD＞0.03，說明多肽過量未全部偶聯(lián)。如果沒有Nano分光光度計(jì)，直接觀察顏色，顏色變黃，說明游離—SH過量。 2.2 稱取20mg多肽溶解于5ml交聯(lián)緩沖液(0.1M PB，0.15M NaCl)中，配成【4mg/ml的多肽溶液】（對(duì)于難溶肽，可用≤30%的DMSO溶解），一般我們只偶聯(lián)5～10mg多肽，等比例縮小體積即可。 2.3 將第1.4步透析好的cKLH與第5步配好的【4mg/ml多肽溶液】混合，室溫(25℃)4h。（此處可檢測多肽是否偶聯(lián)充分，檢測方法見2.1 Ellman試劑法檢測多肽-SH狀態(tài)） 2.4 最后用10kD的透析袋于PBS（pH7.2）中透析除去游離未偶聯(lián)的多肽，至少換液4次。每次2h，磁力攪拌器上攪拌透析，調(diào)整到合適濃度分裝成小管，-20℃保存。 3．Ellman試劑檢測多肽-SH狀態(tài)評(píng)估載體與多肽偶聯(lián)效率 方法見“2.1 Ellman試劑法檢測多肽-SH狀態(tài)”。 二、Frdbio EDC或EDC/NHS介導(dǎo)多肽與載體偶聯(lián) 1. 將載體蛋白cKLH（Frdbio，Cat No.: BCJ0002） 溶解在偶聯(lián)緩沖液（0.1M MES，pH4.7），終濃度10mg/ml。 2. 將待偶聯(lián)多肽溶解在偶聯(lián)緩沖液(0.1M MES，pH4.7)，終濃度4mg/ml。 3. 將步驟1)和步驟2）的溶液混合，多肽與載體蛋白摩爾比為10:1。 4. 將EDC試劑（Frdbio）溶解在偶聯(lián)緩沖液(0.1M MES，pH4.7)中配制成1M EDC溶液。 5. 步驟3的混合液在磁力攪拌下，緩慢滴加步驟4）的EDC溶液（EDC滴加的摩爾量與多肽相同），置25℃磁力攪拌反應(yīng)2h。 （如果此過程中，產(chǎn)生沉淀應(yīng)該減少EDC的用量直到得到可溶性溶液為止。） 6. 透析或凝膠過濾去除未偶聯(lián)的多肽和EDC試劑，并置換成PBS溶液(0.01M PBS,pH7.4)。 （NHS與EDC可以顯著提高偶聯(lián)效率，如果采用此方案，只需要在步驟5）中加入NHS至終濃度為5mM即可。） 三、Frdbio GA( Glutaraldehyde,戊二醛)介導(dǎo)多肽與載體偶聯(lián) 1. 將含氨基的載體蛋白溶解在偶聯(lián)緩沖液（0.1M 碳酸鹽，0.15M NaCl，pH8.5），終濃度2mg/ml。 2. 將待偶聯(lián)多肽溶解在步驟1）的溶液中，終濃度2mg/ml左右，多肽與載體蛋白摩爾比例20:1～40:1最好。 3. 在上述溶液中加入新鮮GA至中濃度為1%，4℃磁力攪拌器上反應(yīng)2～4h。 （戊二醛最好在通風(fēng)櫥操作，避免接觸皮膚和眼睛。） 4. 反應(yīng)完畢，在上述溶液溶液中加入硼氫化鈉至終濃度為10mg/ml, 4℃磁力攪拌器上反應(yīng)1h。 5. 透析或凝膠過濾去除未偶聯(lián)的多肽和GA試劑，并置換成PBS溶液（0.01M PBS,pH7.4）。 |
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