FFL“抗衰老”功能食品創(chuàng)新技術(shù)合集 | NMN、PQQ、神經(jīng)酸

中國生命營養(yǎng) 2024-05-19 發(fā)布于浙江

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FFL作為中國領(lǐng)先的一站式農(nóng)業(yè)食品科技創(chuàng)新服務(wù)平臺，以數(shù)據(jù)驅(qū)動的“科技+產(chǎn)業(yè)+人才+資本”服務(wù)體系，通過科研成果轉(zhuǎn)化、科研專家智庫營銷、新品研發(fā)與孵化、產(chǎn)業(yè)基金投資、創(chuàng)新工作坊等多種方式聚焦食品科技創(chuàng)新領(lǐng)域，專注食品科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新孵化與投資。平臺幫助科學家提升科研成果的商業(yè)價值，同時與產(chǎn)業(yè)公司、政府園區(qū)共同投資孵化創(chuàng)新食品項目。

FFL免費對企業(yè)提供技術(shù)對接，對食品科技創(chuàng)新與投資感興趣的科學家、投資人、創(chuàng)新企業(yè)與產(chǎn)業(yè)公司，歡迎聯(lián)系未來食品實驗室負責人李朋強

FFL研究分析了國內(nèi)外最受歡迎的功能性食品爆款所使用創(chuàng)新原料，并針對當前原料生產(chǎn)技術(shù)痛點進行洞察，在FFL科研庫中找到對應(yīng)技術(shù)解決方案，提供給業(yè)內(nèi)人士參考。歡迎聯(lián)系FFL了解創(chuàng)新技術(shù)詳情。

整理｜趙瑩娜

編輯｜王嘉怡

來源｜未來食品實驗室

原料一：NMN

抗衰老作用

人體衰老的主要原因之一是體內(nèi)NAD+水平下降，NMN是目前NAD+最高效、最直接的合成途徑，可以通過提高機體內(nèi)的NAD+水平發(fā)揮抗衰老的作用。有研究發(fā)現(xiàn)NMN能夠改善細胞線粒體功能從而抑制間充質(zhì)干細胞的衰老，作用機制為上調(diào)細胞內(nèi)的NAD+含量及Sirt3過表達。

生產(chǎn)技術(shù)

目前，NMN的合成方法主要有化學合成、酶法合成和生物合成三種途徑?；瘜W合成NMN需要先合成煙酰胺核苷，通常從核糖衍生物和煙酸衍生物開始，成本高、環(huán)境污染嚴重；酶法合成效率較高，但存在操作復(fù)雜、成本高等缺陷；生物發(fā)酵法是利用細胞將底物轉(zhuǎn)化為特定產(chǎn)物的過程，由于減少了傳統(tǒng)酶催化細胞裂解和蛋白質(zhì)濃縮等步驟，因此具有選擇性高、催化活性強、成本效益高等獨特優(yōu)勢。據(jù)2021年研究報道，以煙酰胺和葡萄糖為底物，發(fā)酵法生產(chǎn)NMN最高產(chǎn)量為6.79g/L。目前發(fā)酵液中NMN產(chǎn)品濃度較低，嚴重阻礙了發(fā)酵法合成NMN技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。因此，亟需開發(fā)一種更高效的NMN生物發(fā)酵合成工藝。

技術(shù)內(nèi)容

為解決上述問題，此技術(shù)建立了以NR和ATP為底物，通過NRK一步法直接轉(zhuǎn)化為NMN的全細胞合成體系，同時引入ATP再生系統(tǒng)以實現(xiàn)ADP到ATP再生，并通過發(fā)酵條件的優(yōu)化使NMN產(chǎn)量達11 .81g/L。此技術(shù)構(gòu)建的基于E .coli BL21(DE3)-pET28a-NRK、E .coli BL21(DE3)-pET28a-PPK的全細胞雙菌耦合發(fā)酵體系，實現(xiàn)了基于工程菌E .coli BL21(DE3)-pET28a-PPK的ATP再生系統(tǒng)在E .coli BL21(DE3)-pET28a-NRK合成NMN中的應(yīng)用。該雙菌耦合發(fā)酵系統(tǒng)可以通過ATP循環(huán)再生實現(xiàn)ATP持續(xù)供給，降低了整個發(fā)酵體系的生產(chǎn)成本，實現(xiàn)煙酰胺核糖到煙酰胺單核苷酸的連續(xù)化合成。

全細胞雙菌耦合發(fā)酵體系不僅減少了傳統(tǒng)酶催化過程破碎、提取、純化等步驟所需要的成本，而且用更便宜的材料Poly-P將ADP磷酸化為ATP，實現(xiàn)ATP的循環(huán)，減少了對外源ATP的需求量，使生產(chǎn)成本大大降低，且雙菌株優(yōu)化后的NMN發(fā)酵產(chǎn)量達11 .81g/L，這是目前發(fā)酵法合成NMN的最高產(chǎn)量報道，比2021年日本報道的6 .79g/L高出了73.93％。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

圖2 NRK合成NMN的產(chǎn)物鑒定分析

圖3 PPK合成ATP的產(chǎn)物鑒定分析

圖4 不同工程菌對NMN合成的影響

圖5 不同誘導(dǎo)條件對誘導(dǎo)效果的影響

圖6 通透性處理對NMN合成的影響

圖7 不同因素對NMN合成的影響

圖8 耦合發(fā)酵對NMN產(chǎn)量的影響

圖9 不同因素對耦合發(fā)酵產(chǎn)NMN的影響

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原料二：PQQ

抗衰老作用

在各種抗衰老成分中，PQQ獨特的抗衰老機制讓它備受關(guān)注。在生物的抗衰老過程中，起關(guān)鍵作用的有兩大元素：保護并修復(fù)線粒體，以及清除自由基。線粒體被喻為我們體內(nèi)的能源工廠，隨著年齡的增長，線粒體的數(shù)量和功能會逐漸下降，導(dǎo)致機體老化。PQQ能夠促進線粒體的生成和修復(fù)，延緩機體老化的過程。自由基是導(dǎo)致我們體內(nèi)多種疾病的“元兇”，而PQQ則具有強大的自由基清除能力，從而發(fā)揮卓越的抗衰老功效。

生產(chǎn)技術(shù)

目前，PQQ的制備方法主要有微生物發(fā)酵和化學合成方法。已報道的PQQ化學合成方法需要經(jīng)過十步以上的反應(yīng)才能獲得，產(chǎn)率低，并且需要使用大量有毒試劑和重金屬催化劑，對環(huán)境破壞比較大。發(fā)酵法生產(chǎn)制備生物活性物質(zhì)是目前國內(nèi)外公認的綠色環(huán)保獲取生物醫(yī)藥原料的方法。但是，吡咯喹啉醌屬于基因轉(zhuǎn)錄翻譯后多肽經(jīng)修飾生成的產(chǎn)物，受基因轉(zhuǎn)錄控制、修飾反應(yīng)限速等因素影響，與其他發(fā)酵精細化工產(chǎn)品相比，PQQ發(fā)酵產(chǎn)物濃度仍然較低。另外，由于PQQ強極性、水溶性、發(fā)酵液成分復(fù)雜的特點，常規(guī)天然產(chǎn)物分離純化手段只適用于中等極性脂溶性化合物分離。因此，從發(fā)酵液中分離純化PQQ難度加大，產(chǎn)業(yè)化開發(fā)PQQ必須解決分離純化技術(shù)難題。

技術(shù)內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，此技術(shù)的目的是提供一種利用超分子溶劑萃取法分離純化PQQ的方法。此技術(shù)中的超分子溶劑萃取法，有效克服了傳統(tǒng)有機溶劑物理萃取法對水溶性成分PQQ萃取率低的不足，利用超分子溶劑從發(fā)酵液中萃取富集PQQ，而制備得到高純度的PQQ。所用的超分子萃取劑由季銨型陽離子表面活性劑、烷烴和烷醇通過超分子自組裝而形成。基于PQQ羧酸基團與陽離子表面活性劑之間的離子對絡(luò)合作用，以及表面活性劑上芐基與PQQ吡咯環(huán)的π-π絡(luò)合作用，該超分子萃取劑從發(fā)酵液中高效、高選擇性地萃取PQQ。

此技術(shù)基于對PQQ結(jié)構(gòu)特異性的認知，構(gòu)建了針對PQQ結(jié)構(gòu)的特定超分子溶劑。該超分子溶劑是由兩親性化合物通過溶劑中分子間非共價鍵的相互作用和自組裝過程，形成一種具有納米結(jié)構(gòu)的液體。首先，具有兩親性質(zhì)的化合物（如兩親分子單體）在兩親性結(jié)構(gòu)/濃度的誘導(dǎo)下自組裝形成兩親性聚集體的膠束液滴（或膠體溶液）；然后，這些單個膠束液滴在疏水作用下聚集形成更大的凝聚體；最后，在外界環(huán)境條件誘導(dǎo)（如pH、溫度、電解質(zhì)、溶劑）作用下，形成不溶于水的納米尺度的凝聚體與水相分離，形成超分子溶劑，即不溶于水的正向膠束、反向膠束、及囊泡。根據(jù)兩親分子及分散劑或有機溶劑種類的不同，超分子溶劑有的在水相上層，有的在水相下層。因超分子溶劑為納米狀態(tài)，因此與萃取液接觸面積大，傳質(zhì)效率和萃取效率都較高。然后利用溶劑的擺動效應(yīng)，用氯化鈉鹽溶液進行反萃取，從而實現(xiàn)萃取劑的再生過程，可以減少溶劑損耗，且操作相對簡單，分離效率高，其中PQQ產(chǎn)率在90％以上，純度可達97％，均高于常規(guī)分離純化方法（產(chǎn)率低于70％，純度低于80％），且成本低、污染少，便于快速連續(xù)操作，可應(yīng)用于PQQ的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖1 超分子溶劑對PQQ的多向絡(luò)合作用原理圖

圖2 超分子溶劑的自組裝過程原理圖

圖3 PQQ的紫外光譜圖

圖4 HPLC分析結(jié)果圖

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原料三：神經(jīng)酸

抗衰老作用

大腦中的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞損傷和死亡，導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默?。ˋD）和帕金森病（PD）等疾病。神經(jīng)酸缺乏會導(dǎo)致記憶力減退、AD以及更嚴重的腦部疾病，如腦卒中后遺癥、腦萎縮等。研究人員發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酸對６-羥基多巴胺（６-OHDA）誘導(dǎo)的PD（大鼠嗜鉻細胞瘤PC-12）細胞模型的神經(jīng)保護作用，發(fā)現(xiàn)６-OHDA處理之前用神經(jīng)酸處理，細胞活力顯著增加，而且在神經(jīng)酸預(yù)處理細胞中的MDA水平降低，表明該組細胞氧化應(yīng)激降低，證明神經(jīng)酸有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

生產(chǎn)技術(shù)

神經(jīng)酸獨特的保健作用對人體健康具有重要意義，但人體細胞很難合成神經(jīng)酸，主要依賴外源攝入。目前，神經(jīng)酸的獲得主要依靠直接提取法和化學合成法。神經(jīng)酸的化學合成自20世紀30年代就已實現(xiàn)，雖然不斷改進但此種方法得率低且產(chǎn)物難提純，至今未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。雖然采用植物基因工程的方法，可在油料作物中實現(xiàn)大量積累神經(jīng)酸的目的。但是有限的植物資源由于其對生長條件要求苛刻，無法像油菜等農(nóng)作物那樣可高效產(chǎn)油脂或?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模廣泛的種植。即油料作物相對于微生物細胞而言，具有生長速度慢、占用耕地等缺點。因此采用微生物高產(chǎn)神經(jīng)酸更具有可行性，而高產(chǎn)油脂的酵母是最好的宿主選擇之一。

技術(shù)內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，該技術(shù)提供了一條綠色經(jīng)濟、可持續(xù)發(fā)展的神經(jīng)酸生產(chǎn)方法。該方法提供了一種高產(chǎn)神經(jīng)酸的基因工程菌株，該基因工程菌株通過發(fā)酵可以穩(wěn)定的高效合成富含神經(jīng)酸的油脂。

該技術(shù)中的工程菌株以圓紅冬孢酵母為出發(fā)菌株，異源表達不同底物偏好性的脂肪酸延伸酶復(fù)合物中的KCS酶；過表達脂肪酸延伸酶復(fù)合物中的KCR、HCD和ECR酶，以及蘋果酸酶ME1。最終，該技術(shù)中構(gòu)建的高產(chǎn)神經(jīng)酸的菌株，在50L發(fā)酵罐水平上實施分批補料發(fā)酵，油脂和神經(jīng)酸滴度分別達到73.7 g/L和35.4 g/L，該水平為當前所有文獻報道中的最高發(fā)酵水平。

這項技術(shù)首次通過在產(chǎn)油微生物中過表達FAE中的KCR、HCD和ECR，強化FAE途徑；過表達ME1基因提升胞質(zhì)內(nèi)NADPH供給；并結(jié)合各KCS的組合表達，實現(xiàn)了重組菌株高產(chǎn)神經(jīng)酸的目的，具有潛在的工業(yè)化生產(chǎn)價值。

圖1 搖瓶發(fā)酵后NA0315菌株的脂肪酸組成含量占比

圖2 發(fā)酵過程曲線

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