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基于透明化包埋技術(shù)的 外周神經(jīng)連接圖譜成像  本期青科沙龍關(guān)鍵詞 TESOS技術(shù) 透明化包埋 投射重建 fMOST技術(shù)  生物醫(yī)學(xué)成像正在由二維走向三維。獲取完整的生物組織介觀尺度三維結(jié)構(gòu)信息是生命科學(xué)基礎(chǔ)研究的重要目標(biāo)。然而，組織的不透明性極大地阻礙了光學(xué)成像的深度。為什么生物物質(zhì)看起來是不透明的呢？首要原因是光的散射。生物組織中含有水、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等多種成分，其不均勻分布會導(dǎo)致光發(fā)生強(qiáng)烈的散射，使光無法直接穿過組織。另一方面，機(jī)體內(nèi)的血紅蛋白、黑色素等物質(zhì)可吸收光，限制光線通過。為了解決上述兩個問題，組織透明化技術(shù)由此誕生。一方面，通過脫色技術(shù)減少光的吸收，另一方面，利用含有高折射率介質(zhì)的透明液取代樣本中水分和脂質(zhì)，平衡組織折射率，減少光的散射，從而使組織實(shí)現(xiàn)光學(xué)透明。 一個常見生活現(xiàn)象可以很好地幫助我們理解組織透明化技術(shù)的原理。當(dāng)我們把一整塊透明的冰砸碎后，冰渣是不透明的白色。因?yàn)槔锩娴乃?、冰、空氣三種組分折射率差異巨大。接著我們把碎冰放入水中，冰渣會立刻變回透明。組織透明化技術(shù)的過程其實(shí)與此過程原理完全一致。
2024年1月3日，北京腦科學(xué)與類腦研究所趙瑚教授團(tuán)隊(duì)于Cell Research發(fā)表封面文章Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system，報道了這一新技術(shù)及其應(yīng)用。 1 研究過程  接著，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計了一套放置樣本的Magmount裝置。該裝置用于將透明化包埋樣本放置于顯微鏡載物臺，同時實(shí)現(xiàn)樣本的靈活轉(zhuǎn)移和精確復(fù)位。有了透明化包埋樣本 Magmount裝置 石蠟切片機(jī)，TESOS技術(shù)可以與市面上幾乎所有商用正置共聚焦/雙光子/光片顯微鏡體系（Leica, Nikon, Olympus, Zeiss, 3i等等）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)任意組織類型大樣本高分辨成像。無需單獨(dú)開發(fā)專用成像系統(tǒng)，也無需對顯微鏡本身做改動。這種高度的靈活性是TESOS技術(shù)的一個巨大優(yōu)勢。與傳統(tǒng)切片成像體系比如fMOST，ViSoR 或者M(jìn)ouselight相比，TESOS大大降低了神經(jīng)連接圖譜成像這一高大上技術(shù)的實(shí)現(xiàn)成本。 透明化包埋后的樣本拍攝過程簡單明了。樣本粘結(jié)于Magmount裝置，一起固定于載物臺上，用選定鏡頭像拍切片一樣對樣本表面三維圖像塊進(jìn)行深度成像。拍攝深度取決于鏡頭工作距離以及對分辨率的需求。拍完表淺區(qū)塊后，將樣本轉(zhuǎn)移至石蠟切片機(jī)切削掉成像過的區(qū)域（或使用電機(jī)磨削），然后再轉(zhuǎn)移回顯微鏡拍攝下一個三維圖像塊。最后基于圖像塊之間的重疊區(qū)域拼接為完整的大三維圖像塊。比如說，我們可以使用最常用于拍攝切片的高分辨率40×/1.3NA 油鏡 （工作距離240微米）拍攝樣本表面大概350微米厚度的樣本（TESOS樣本無需蓋玻片，從而可以拓展170微米的工作距離），然后切片機(jī)切削去約300微米厚度，接著拍攝下一個350微米厚度組織塊。最后通過約50微米的重疊區(qū)將上下兩個圖像塊拼接成為一個650微米厚度連續(xù)圖像塊。重復(fù)上述操作，就可使用高分辨率短工作距離鏡頭拍攝任意大小樣本。小型的圖像數(shù)據(jù)拼接（小于100GB）可以用Image J實(shí)現(xiàn)。團(tuán)隊(duì)自己也編寫了TESOS-Stitcher軟件用于更大規(guī)模圖像數(shù)據(jù)的拼接。   TESOS透明化包埋后利用光片顯微鏡進(jìn)行成年小鼠全身神經(jīng)成像 （雙通道拍攝，樣本總體積100×35×20mm3，總拍攝時長120小時，原始數(shù)據(jù)量約70TB） 與光片顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡具有更高的成像分辨率、更好的成像效果，高倍鏡下能夠獲得更多的生物學(xué)細(xì)節(jié)。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用TESOS透明化包埋結(jié)合徠卡共聚焦顯微鏡20×/0.95NA鏡頭成像，對新生小鼠全身的神經(jīng)分布進(jìn)行了亞微米級分辨率的重建。 大樣本的高質(zhì)量高分辨率成像是神經(jīng)投射研究的重要挑戰(zhàn)之一。團(tuán)隊(duì)充分發(fā)揮TESOS透明化包埋的技術(shù)優(yōu)勢，利用共聚焦顯微鏡40×/1.3NA鏡頭，先后完成了小鼠大腦皮層一個1.5毫米厚度腦組織塊的亞微米級分辨率成像、包含肌肉和椎骨的小鼠背根神經(jīng)節(jié)及相應(yīng)的脊髓內(nèi)感覺神經(jīng)亞微米級分辨率成像（、以小鼠前爪為代表的單軸突分辨率外周神經(jīng)組織成像，并通過病毒標(biāo)記的手段完成了支配小鼠前爪肉墊的其中12個感覺神經(jīng)元在脊髓內(nèi)投射的重建及分析。 最后的終極技術(shù)挑戰(zhàn)是感覺神經(jīng)元的全貌重建。一個感覺神經(jīng)元其外周末梢可以遠(yuǎn)在指尖，連接的傳入神經(jīng)纖維穿行于各類復(fù)雜軟硬組織，將承載著感覺信號的電刺激傳遞到位于脊髓背根神經(jīng)節(jié)的胞體，然后再通過中樞分支投射到脊髓內(nèi)部。正是由于這樣復(fù)雜而長的組織結(jié)構(gòu)，哺乳動物的單個感覺神經(jīng)的全貌從來沒有被完整重建。 團(tuán)隊(duì)利用成體Thy1-EGFP小鼠，進(jìn)行了皮膚上的感覺神經(jīng)末梢到背根神經(jīng)節(jié)再到脊髓的跟蹤拍攝，繪制了5個神經(jīng)元的完整投射行程，實(shí)現(xiàn)了單個神經(jīng)元從外周到中樞投射重建的技術(shù)突破。 2 研究結(jié)論 TESOS是對傳統(tǒng)組織透明化及三維成像技術(shù)的一種理念革新。其核心概念在于“透明”和“包埋”?！巴该鳌笔荰ESOS與基于超薄切片的大尺度三維成像技術(shù)（以fMOST為代表）的最大區(qū)別。聚合后的良好透明度保證了成像質(zhì)量，也使得TESOS技術(shù)與包含光片顯微鏡、共聚焦顯微鏡等多種成像系統(tǒng)的有機(jī)結(jié)合成為可能。TESOS包埋形成的有機(jī)樹脂與其他水性透明化技術(shù)中的瓊脂糖包埋凝膠截然不同，其良好的機(jī)械硬度及切割性能大大提高了操作的穩(wěn)定性，切削（磨削）后樣品變形小，數(shù)據(jù)拼接及重建具有良好的準(zhǔn)確性。這一特性使得TESOS相較于ViSoR2（目前多用于大腦樣品處理）有更廣泛的適用范圍，能夠同時適用于中樞及外周的處理與成像。 原文鏈接 Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system | Cell Research (nature.com) 直  四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院伊亞婷博士、張士文博士、門乙博士、北京腦科學(xué)與類腦研究所博士生研究生李有淇為論文的共同第一作者，北京腦科學(xué)與類腦研究所趙瑚教授、戈鵡平教授、曲靖醫(yī)科大學(xué)何永文教授為論文的共同通訊作者。 神經(jīng)成像的相關(guān)研究一直是科研的熱門方向，在調(diào)研了一線科研工作者的需求后，我們聯(lián)系并邀請到了本文通訊作者：北京腦科學(xué)與類腦研究中心高級研究員——趙瑚對本項(xiàng)研究進(jìn)行分享。 1 講者信息 北京腦科學(xué)與類腦研究中心高級研究員——趙瑚 2 主辦平臺 華安生物、深究科學(xué)、生物世界 3 直播時間 2024年3月12日 20:00-21:00 |
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