蛋白質(zhì)降解速率和半衰期的研究對于了解蛋白質(zhì)功能、開發(fā)調(diào)節(jié)疾病特異性蛋白質(zhì)降解的藥物以及研究調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平的小分子化合物具有重要意義。蛋白質(zhì)豐度的調(diào)節(jié)對于維持正常的細胞功能至關(guān)重要，細胞中的所有蛋白質(zhì)都在不斷被降解和替換。

真核細胞有兩種主要的蛋白質(zhì)降解途徑——泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑。其他具體的降解途徑可以閱讀往期文章：《5種蛋白質(zhì)降解途徑你都了解嗎？》

泛素-蛋白酶體途徑是細胞中蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與各種蛋白質(zhì)的降解。它以一種特定的、高度復(fù)雜的機制降解細胞中的蛋白質(zhì)，并且可以通過去泛素化酶來逆轉(zhuǎn)。自噬-溶酶體途徑是一種自我降解過程，它通過溶酶體介導(dǎo)降解蛋白質(zhì)，通過包被蛋白質(zhì)并形成自噬溶酶體來滿足細胞的代謝需求。這兩種途徑在維持細胞正常的蛋白質(zhì)代謝中都起著至關(guān)重要的作用，蛋白質(zhì)的異常降解可能導(dǎo)致許多疾病，尤其是神經(jīng)退行性疾病和癌癥。

蛋白質(zhì)的半衰期變化很大，從幾分鐘到幾天不等，蛋白質(zhì)降解速率的不同對蛋白質(zhì)功能很重要。常用的檢測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法包括：

（1）脈沖追蹤測定；（2）質(zhì)譜技術(shù)；（3）CuAAC（銅催化疊氮化物-炔烴環(huán)加成物）標(biāo)記法；（4）蛋白質(zhì)降解途徑抑制劑；（5）CHX（環(huán)己酰亞胺）法。

（1）脈沖追蹤測定法是基于將放射性核素標(biāo)記的氨基酸（例如S35標(biāo)記的蛋氨酸）添加到細胞培養(yǎng)基中，進而細胞中特定蛋白質(zhì)的變化過程可以通過免疫印跡或其他方法檢測。然而，這種方法使用同位素，對研究人員的健康和安全有一定的負面影響，操作過程復(fù)雜。

（2）近年來，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的降解。因此，通過質(zhì)譜法檢測蛋白質(zhì)降解可用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和質(zhì)量控制。

（3）此外，據(jù)報道，CuAAC（銅催化疊氮化物-炔烴環(huán)加成物）可用于標(biāo)記細胞中新合成的蛋白質(zhì)，因而可用于研究蛋白質(zhì)降解。

（4）蛋白質(zhì)降解研究還可以通過添加抑制劑來研究細胞降解途徑。例如，蛋白酶體抑制劑如MG-132、環(huán)氧霉素和硼替佐米通過阻斷通過泛素-蛋白酶體途徑來抑制蛋白質(zhì)降解。氯喹和巴弗洛霉素A1等抑制劑通過中和溶酶體中的酸性 pH值起作用，因為pH值是溶酶體蛋白酶功能所必需的，因此氯喹和巴弗洛霉素A1能夠抑制溶酶體途徑介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解。

（5）研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的最常用方法是蛋白質(zhì)翻譯阻滯劑環(huán)己酰亞胺（CHX）。

CHX簡介：CHX是灰鏈霉菌的產(chǎn)物，可用于確定分子生物學(xué)中蛋白質(zhì)或酶的半衰期。CHX是一種翻譯抑制劑，可以阻斷真核核糖體易位過程。值得注意的是，CHX可以抑制真核蛋白合成但不能抑制原核蛋白質(zhì)合成。CHX的優(yōu)點是易于操作，不需要考慮正在進行的蛋白質(zhì)合成的影響，并且可以進行高通量篩選。另一方面它的主要缺點是 i） 在沒有特異性的情況下阻斷所有蛋白質(zhì)翻譯，以及 ii） 具有高細胞毒性，長期處理后可引起大規(guī)模細胞死亡，故不適用于降解速度較慢的蛋白質(zhì)。因此，需要根據(jù)合適的條件選擇CHX。

CHX使用方法：簡單來說就是用適當(dāng)濃度的CHX處理細胞（通常為100μg/mL），處理不同時間點收集細胞進行WB實驗檢測隨著處理時間的延長，蛋白質(zhì)水平的變化。

結(jié)果分析：半衰期短的蛋白質(zhì)會隨著時間的推移迅速降解，而半衰期長的蛋白質(zhì)隨著時間的推移，降解的很少。因此，CHX可以在不使用放射性同位素的情況下有效地可視化蛋白質(zhì)降解的速度。

案例分析：在下面這個案例中，用50μg/mL的CHX處理6h和12h，WB檢測蛋白表達，發(fā)現(xiàn)敲低AHI1加速了Tyk2的蛋白質(zhì)降解。需要注意的是，內(nèi)參蛋白Tublin比較穩(wěn)定，所以即便CHX處理12h，Tublin也沒有明顯的降解。

敲低AHI1加速了Tyk2的蛋白質(zhì)降解（Ying Miao et al. 2023. bio protocol）

需要注意的是，蛋白質(zhì)的降解速率彼此之間差異很大。因此，在進行正式的實驗之前，需要先摸索一下目的蛋白質(zhì)降解的速度。一般建議設(shè)置少至5個時間點來檢測蛋白質(zhì)的半衰期，以確?？梢杂^察到明顯的蛋白質(zhì)降解的變化趨勢。

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