泛素化修飾的研究和文章套路無非就“三板斧”-E3酶、泛素化類型和泛素化位點，天下文章不出其右，學會這個三板斧基本上就可以在泛素化研究上行走江湖了。在做泛素化研究的家人們照著這篇文章的套路和方法直接抄過來就行了。

這篇文章套路一定要吃透！

這篇文章套路一定要吃透！

這篇文章套路一定要吃透！

需要泛素化全套16個質(zhì)粒的可以聯(lián)系小編。具體有哪些可以瀏覽往期文章：了解這些泛素化質(zhì)粒的命名，給師弟好好上一課

今天我們就通過一篇文章看看別人是怎么通過泛素化修飾的“三板斧”行走江湖的?！禤SMD12介導的甲型流感病毒M1在K102位點的泛素化修飾調(diào)節(jié)病毒復制》

第一斧：找到E3泛素連接酶。目前用的最多的找未知的E3泛素連接酶的方式是IP-MS。在這篇文章中，作者也是先在DF-1細胞中過表達H5N6流感病毒的M1蛋白，然后用IP-MS找到一些和M1互作的候選蛋白。將這些候選基因克隆到質(zhì)粒上，繼續(xù)在DF-1細胞中過表達，然后感染H5N6流感病毒，發(fā)現(xiàn)3個促進H5N6流感病毒復制的蛋白，5個抑制H5N6流感病毒復制的蛋白（圖1）。其中PSMD12促進作用最強，所以作者選擇PSMD12進行下一步驗證。

圖1：鑒定PSMD12促進H5N6流感病毒增殖（Xianfeng Hui et al. 2022. J Virol）

因為過表達PSMD12能夠促進H5N6流感病毒增殖，所以作者就通過敲低PSMD12抑制H5N6流感病毒增殖來反向驗證這個結(jié)論。作者設(shè)計了3對siRNA，在DF-1細胞中敲低PSMD12，通過WB，生長曲線病毒滴度說明敲低PSMD12抑制H5N6流感病毒增殖。然后完全一樣的套路在A549細胞中重復了這個結(jié)論。圖2數(shù)據(jù)看著多，其實很簡單，很多都是強行湊圖的。

圖2：敲低PSMD12抑制H5N6流感病毒復制（Xianfeng Hui et al. 2022. J Virol）

前面圖1是通過IP-MS鑒定到PSMD12和M1互作的。這里作用又用Co-IP在DF-1、293T等細胞中證明了PSMD12和M1互作。然后用間接免疫熒光（IFA）在DF-1、HeLa和A549細胞中證明了PSMD12和M1共定位。

圖3：PSMD12和M1互作（Xianfeng Hui et al. 2022. J Virol）

第二斧：找到底物的泛素化類型。前面已經(jīng)找到了E3泛素連接酶PSMD12，并且能和流感病毒的M1互作。下一步自然而然就是驗證PSMD12泛素化M1，然后找到M1的泛素化類型。首先作者共轉(zhuǎn)M1和Ub，通過CO-IP證明M1可以被泛素化修飾。然后過表達PSMD12，促進了M1的泛素化修飾。因為泛素分子Ub上有7個K位點可以連接到底物上：K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63。所以作者分別用這些類型的Ub和M1共轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)M1能夠發(fā)生K6、K11、K29、K33、K48和K63類型的泛素化修飾。然后分別用這些類型的Ub和M1以及PSMD12共轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)PSMD12促進了M1的K63類型的泛素化。說明，PSMD12促進M1的K63泛素化修飾。

插播一句：這里M1可以發(fā)生6種類型的泛素化修飾，說明至少應該對應有6種不同的E3酶和M1互作，促進M1的不同泛素化修飾。并且，M1上的K（賴氨酸）位點比較多，自然就有很大的概率發(fā)生類泛素化（比如Sumoylation,neddylation,ISGylation等）和乙酰化這些其他的修飾。沒做的點可以繼續(xù)挖一挖。本觀點僅供娛樂，請自行鑒別。

圖4：PSMD12促進M1的K63泛素化修飾（Xianfeng Hui et al. 2022. J Virol）

第三斧：找到底物的泛素化位點。在第一斧和第二斧打完之后，我們知道了E3泛素連接酶PSMD12促進流感病毒M1的K63泛素化修飾。在第三斧找泛素化位點的時候，如果底物的K數(shù)量少的話，可以直接一個個將K突變成R。如果底物上K的數(shù)量較多的話，需要先預測一下，減少工作量。作者先用BDM-PUB (http://bdmpub./results.php) 和UBPRED (http:// www.ubpred.org/)軟件對M1的可能泛素化位點進行了預測，結(jié)果顯示M1的K21, K35, K98, K101, K102, K113, K187和K242這8個位點可能會被泛素化修飾。所以作者分別構(gòu)建了這8個位點的K-R突變。然后就是常規(guī)套路，Ub、M1以及K-R突變和PSMD12共轉(zhuǎn)后做Co-IP，發(fā)現(xiàn)PSMD12不能促進M1-K102R突變體的泛素化修飾。然后作者用Ub-K63，M1以及M1-K102R突變和PSMD12共轉(zhuǎn)后做Co-IP，發(fā)現(xiàn)PSMD12不能促進M1-K102R突變體的K63泛素化修飾。最后通過Co-IP和IFA又說明了M1-K102R突變和PSMD12的互作和共定位減弱了。

到此為止，泛素化修飾的三板斧已經(jīng)打完了。說明了一個問題，就是PSMD12和流感病毒的M1互作，促進M1的K102位點發(fā)生K63類型的泛素化修飾。之后就是一些常規(guī)的表型驗證，檢測一下流感病毒M1的K102位點的K63泛素化修飾對病毒的復制和致病性的影響，這里就不再贅述了。

剛?cè)肟拥募胰?，不知道怎么研究一個蛋白質(zhì)的功能的，或者想學基礎(chǔ)知識的，可以購買下方鏈接的《功能蛋白質(zhì)研究》。小編當時買的價格是126,這本書知道的少，賣的不好，庫存少，價格可能會有幾塊錢的上下浮動。整本書大約430頁，目錄都占了7頁，內(nèi)容相當全。小編本碩博一路都看這本書，非常給力。

對細胞生物學實驗技術(shù)還不熟悉的，可以搞一本實驗指導看看，照著里面步驟就行了，從此不到處求人問步驟。

如果你覺得有用的話，就幫忙點個「贊」和「再看」吧。