中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所郭斐課題組在 Cell Reports Methods 期刊發(fā)表了題為：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究論文。

該研究建立了一種快速精準(zhǔn)的猴痘病毒檢測(cè)方法，通過將等溫?cái)U(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測(cè)體系聯(lián)合，可以實(shí)現(xiàn)猴痘病毒DNA在30分鐘內(nèi)的快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度1個(gè)拷貝數(shù)，同時(shí)能夠精準(zhǔn)區(qū)分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的實(shí)用價(jià)值。

研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)了兩個(gè)crRNA的檢測(cè)體系池，其中一組靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守區(qū)D6R和E9L，可以檢測(cè)所有的正痘病毒；另外一組靶向猴痘病毒特有的區(qū)域N3R和N4R。通過對(duì)crRNA的設(shè)計(jì)和篩選，建立了基于CRISPR/Cas12a的熒光報(bào)告體系（圖1）。

圖1：CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系的建立及crRNA的篩選

進(jìn)一步針對(duì)選擇的crRNA，分別檢測(cè)不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒模板以及病毒DNA模板，觀察到CRISPR-Cas12a單獨(dú)檢測(cè)體系的檢測(cè)限約為108拷貝數(shù)，不同crRNA的聯(lián)合可以將檢測(cè)限提高到107拷貝數(shù)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了正痘病毒與猴痘病毒的區(qū)分。并且為了實(shí)現(xiàn)最低檢測(cè)限，研究團(tuán)隊(duì)團(tuán)隊(duì)將等溫?cái)U(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測(cè)體系聯(lián)合，最終能夠達(dá)到1個(gè)拷貝的最低檢測(cè)限，大大提高了檢測(cè)體系的靈敏度（圖2）。

圖2：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系的實(shí)現(xiàn)1個(gè)拷貝的最低檢測(cè)限

為了驗(yàn)證檢測(cè)體系實(shí)際應(yīng)用的可靠性與準(zhǔn)確性，針對(duì)中國(guó)大陸第一例猴痘病例的拭子樣本進(jìn)行了檢測(cè)。該體系同樣實(shí)現(xiàn)了1個(gè)拷貝數(shù)的最低檢測(cè)限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中檢測(cè)到了猴痘病毒的DNA，證實(shí)了體系應(yīng)用的可靠性。同時(shí)針對(duì)猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品的檢測(cè)，陰性參考品中未檢測(cè)到猴痘病毒的DNA，進(jìn)一步證實(shí)了檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性（圖3）。

圖3：RPA聯(lián)合CRISPR/Cas12a檢測(cè)體系對(duì)臨床樣本的檢測(cè)

最終為了提高檢測(cè)效率，進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系到單管中，大大的縮短了檢測(cè)時(shí)間以及操作步驟。在提取得到待測(cè)DNA后，15分鐘到30分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)樣本的快速檢測(cè)，且靈敏度高達(dá)1個(gè)拷貝數(shù)。相比于傳統(tǒng)熒光PCR的2小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)的靈敏度（圖4）。

圖4：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系的優(yōu)化

綜上所述，該研究建立了猴痘病毒的快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，通過crRNA的篩選建立了一套CRISPR檢測(cè)體系，并聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)了猴痘病毒的快速、靈敏的精準(zhǔn)檢測(cè)。為猴痘病毒的快速診斷提供了有力的技術(shù)支持。

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所助理研究員趙斐、博士生胡亞美、范張玲，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心黃保英為論文共同第一作者。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所郭斐研究員、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心譚文杰研究員和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所許豐雯副研究員為論文共同通訊作者，感謝合作者加拿大麥吉爾大學(xué)梁臣教授、北京同仁醫(yī)院房居高教授、北艾斌教授的大力支持。該研究獲得了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新工程、科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。