巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中不可或缺的組成部分，廣泛分布在不同組織中，并在發(fā)育、器官形成、穩(wěn)態(tài)維持和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用【1】。巨噬細胞異質(zhì)性顯著，主要表現(xiàn)在形態(tài)、定位、基因表達譜及功能等方面，這些表型由巨噬細胞的發(fā)育起源和駐留的微環(huán)境所決定【2】。具有組織特異性特征的巨噬細胞包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞（Microglia）、肝臟的枯否細胞（Kupffer cells）和表皮的朗格漢斯細胞（Langerhans cells）等。還有一些分布于多個器官的巨噬細胞，如血管周圍巨噬細胞（Perivascular macrophages）。

基于嚙齒類動物的研究結果，學術界對巨噬細胞亞型的多樣性、發(fā)育起源以及組織特異性的形成有了一定的認識【3】。然而，這些發(fā)現(xiàn)是否適用于人類仍是未知數(shù)，特別是人類胚胎發(fā)育過程中巨噬細胞的多樣性、發(fā)育起源、功能及成熟的動態(tài)過程等問題還缺乏深入而全面的研究。

2023年9月12日，中國科學院深圳先進技術研究院李漢杰課題組聯(lián)合深圳市寶安區(qū)婦幼保健院、深圳大學、上海交通大學和復旦大學等單位在國際頂尖學術期刊 Cell 上發(fā)表了題為：An immune cell atlas reveals the dynamics of human macrophage specification during prenatal development 的研究論文。

研究團隊結合單細胞轉錄組測序、先進的生物信息學手段、多重免疫熒光染色、體外功能實驗等技術，構建了橫跨18個發(fā)育階段、19種組織的人類胚胎免疫系統(tǒng)發(fā)育高分辨率圖譜。研究團隊重點關注了最具組織特異性的巨噬細胞，鑒定了15種巨噬細胞亞型，其中包括兩種新的巨噬細胞亞型，即存在于表皮、睪丸、心臟等外周組織的類小膠質(zhì)細胞（Microglia-like cells）和具有血管生成促進功能并廣泛分布于多個組織中的促血管生成巨噬細胞（Proangiogenic macrophages，PraM）。

該研究通過構建人類產(chǎn)前免疫細胞發(fā)育的時空動態(tài)圖譜，揭示了多種巨噬細胞亞型在發(fā)育過程中的分化起源、空間定位、功能特征及轉錄調(diào)控機制。

人類免疫系統(tǒng)發(fā)育的單細胞時空圖譜

研究團隊對來自受孕后4-26 PCW（Postconceptional Week，PCW）囊括19種人類胚胎組織樣本的免疫細胞進行了單細胞轉錄組測序，獲得了近30萬個高質(zhì)量的免疫細胞

（圖1），并鑒定了11種主要的免疫細胞類型，包括：巨噬細胞（Macrophages）、祖細胞（Progenitor cells）、B 淋巴細胞、T 淋巴細胞、先天淋巴細胞（Innate-like lymphocytes）、自然殺傷細胞（Natural killer cells）、樹突狀細胞（Dendritic cells）、單核細胞（Monocytes）、巨核細胞（Megakaryocytes）、粒細胞（Granulocytes）和紅細胞（Erythrocytes）。在此基礎之上，研究團隊對每一種主要的免疫細胞類型進行了更細致的分類，最終注釋得到56種免疫細胞亞型。

研究團隊重點對巨噬細胞進行了研究并將其進一步細分為了15個亞群。通過時空分析，他們發(fā)現(xiàn)在人類胚胎發(fā)育時期，巨噬細胞就已經(jīng)具有了顯著的組織特異性。在4 PCW左右（器官初形成階段），巨噬細胞前體就已經(jīng)出現(xiàn)在胚胎以及卵黃囊中并一直持續(xù)到大概8 PCW，直到被成熟的組織駐留巨噬細胞所替代。

圖1 構建人類免疫系統(tǒng)發(fā)育時空圖譜

中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的類小膠質(zhì)細胞

在該研究中，研究團隊首次在胚胎多個外周組織（皮膚、心臟及睪丸）中鑒定出一群和小膠質(zhì)細胞有相似基因表達譜特征的巨噬細胞（圖2）。這一發(fā)現(xiàn)打破小膠質(zhì)細胞只存在于腦及脊髓中的傳統(tǒng)認知。這群細胞高表達P2RY12、TMEM119、SALL1、C3等和小膠質(zhì)細胞相同的特征基因，并且在無監(jiān)督聚類分析中，這群細胞也和腦、脊髓中的小膠質(zhì)細胞聚為一類。研究人員因此將這群新發(fā)現(xiàn)的分布在多個外周組織的細胞命名為類小膠質(zhì)細胞（Microglia-like cells）。

流式分析進一步驗證了這群外周組織中的類小膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞一樣，都呈現(xiàn)CD45lowP2RY12+MRC1-的表型。此外，基于多重免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)類小膠質(zhì)細胞在Carnegie Stages 12（CS12）時期就已經(jīng)出現(xiàn)在表皮組織中。在14 PCW之前，類小膠質(zhì)細胞一直是表皮中最主要的免疫細胞，此后細胞比例才開始逐漸減少，在20 PCW之后，基本被朗格漢斯細胞替代。在胚胎心臟中，類小膠質(zhì)細胞最早出現(xiàn)在CS13的主動脈（aorta）中，并且在26 PCW之前一直是主動脈中最主要的免疫細胞。而成人主動脈組織中則檢測不到這群類小膠質(zhì)細胞。在胚胎睪丸中，類小膠質(zhì)細胞最早能夠在CS14的時候被檢測到，主要存在于附睪（epididymis）中的輸出小管（efferent duct）周圍，而在睪丸實質(zhì)（parenchyma）中比例則較低。

圖2 外周器官中的類小膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)中的小膠質(zhì)細胞的表型一致

表皮和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均起源于外胚層，而主動脈和附睪則起源于主動脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros，AGM）區(qū)域。研究團隊推測，小膠質(zhì)細胞以及類小膠質(zhì)細胞的前體從卵黃囊遷移到外胚層和AGM區(qū)域，隨后在這兩個區(qū)域獨立分化為小膠質(zhì)細胞或類小膠質(zhì)細胞。

表皮駐留的類小膠質(zhì)細胞呈極化分布，與神經(jīng)嵴細胞互作并調(diào)控其分化

由于類小膠質(zhì)細胞在表皮中最為豐富，研究團隊進一步研究了它們在表皮組織中的功能。研究團隊發(fā)現(xiàn)，與四肢和腹部皮膚相比，類小膠質(zhì)細胞在背部和頭部表皮中比例更高。在9 PCW時，背部表皮中幾乎所有的免疫細胞都是類小膠質(zhì)細胞，而四肢表皮中約60%的免疫細胞是類小膠質(zhì)細胞。進一步定量分析表明，在胚胎發(fā)育不同階段，背部表皮的類小膠質(zhì)細胞都比四肢表皮更多，分布更密集（圖3）。

類小膠質(zhì)細胞在表皮中的極化分布模式與神經(jīng)嵴細胞（neural crest cells，NCCs）的背外側遷移路線（dorsolateral migration）有類似之處，因此研究人員猜測表皮的類小膠質(zhì)細胞與NCCs之間可能存在某種互作。NCCs是外胚層衍生的多能干細胞，背外側遷移時可分化為黑色素細胞（melanocytes）。通過多重免疫熒光實驗，研究團隊發(fā)現(xiàn)表皮中的類小膠質(zhì)細胞和NCCs之間存在直接的相互作用。與之一致的是，研究團隊觀察到類小膠質(zhì)細胞和黑色素母細胞（melanoblasts）的密度在不同發(fā)育階段沿表皮的背-側-腹軸（dorsal-lateral-ventral axis）逐漸降低（圖3）。

為了評估類小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)嵴細胞分化的影響，研究團隊體外培養(yǎng)了來源于胚胎背部的新鮮皮膚組織塊。在胚胎皮膚中清除類小膠質(zhì)細胞顯著減少了黑色素母細胞的數(shù)量，這提示了類小膠質(zhì)細胞可能會調(diào)控神經(jīng)嵴細胞向黑色素細胞的分化（圖3）。

圖3 表皮駐留的類小膠質(zhì)細胞呈極化分布，與神經(jīng)嵴細胞互作并調(diào)控其分化

廣泛分布于多個臟器中的促血管生成巨噬細胞

研究團隊在多個臟器中都鑒定到了一群高表達促血管生成基因（VEGFA、TNF、IL1B、CXCL8/IL8）的巨噬細胞，并且這群細胞在不同組織中都具有相似的基因表達譜。體外成管實驗也證實了這群細胞促血管生成的功能。他們進一步分析發(fā)現(xiàn)，這群細胞在各個臟器中都富集在血管周圍（圖4）。

圖4 促血管生成巨噬細胞富集在各個器官血管周圍

研究團隊又進一步分析了這群促血管生成巨噬細胞的發(fā)育起源。通過多種擬時序分析算法推斷這群細胞是從卵黃囊起源的巨噬細胞前體分化而來，并且中間經(jīng)歷了一個相對不成熟的前體狀態(tài)（pre-PraM）。擬時序分析推算出的分化軌跡與細胞的真實采樣時間高度一致，并且其促血管生成信號也在隨之增強。此外，研究團隊用成管的內(nèi)皮細胞上清液培養(yǎng)來源于卵黃囊的早期巨噬細胞前體，發(fā)現(xiàn)可以誘導出表達促血管生成基因的巨噬細胞。這些結果明確了這群促血管生成巨噬細胞的發(fā)育起源。

總而言之，該研究通過對人類產(chǎn)前階段近30萬個免疫細胞的單細胞轉錄組分析，著重描繪了15種巨噬細胞亞型的時空動態(tài)變化。突破性的發(fā)現(xiàn)了一群在轉錄組、特征蛋白表達、和形態(tài)上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞類似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類小膠質(zhì)細胞。它們是早期表皮中的主要免疫細胞群，沿背-側-腹軸呈極化分布。這群類小膠質(zhì)細胞可以與神經(jīng)嵴細胞相互作用，并調(diào)節(jié)其向黑色素細胞的分化。通過功能、空間特征、分化軌跡的研究，研究團隊還細致解析了一種尚未被充分了解的促血管生成巨噬細胞，它們駐留在多個器官的血管周圍。這些促血管生成巨噬細胞與小膠質(zhì)細胞均從起源于卵黃囊的巨噬細胞前體分化而來（圖5）。

圖5 巨噬細胞前體分化為小膠質(zhì)細胞/類小膠質(zhì)細胞和促血管生成巨噬細胞；類小膠質(zhì)細胞在表皮與神經(jīng)嵴細胞互作，并調(diào)控其分化

中國科學院深圳先進技術研究院李漢杰研究員、深圳市寶安區(qū)婦幼保健院朱元方教授、深圳大學總醫(yī)院吳雪清教授、上海交通大學醫(yī)學院Florent Ginhoux教授、復旦大學代謝與整合生物學研究院青年研究員王冠琳博士為論文共同通訊作者。中國科學院深圳先進技術研究院客座學生王澤帥（華中農(nóng)業(yè)大學博士研究生）、吳志生（東南大學博士研究生）、研究助理馮若輕；深圳市寶安區(qū)婦幼保健院母胎醫(yī)學研究所陳曉燕博士、王昊博士；復旦大學代謝與整合生物學研究院青年研究員王冠琳博士，廈門大學博士研究生李沐曦、以色列魏茨曼研究所王雙寅博士為論文共同第一作者，深圳先進院為第一單位。

論文特別致謝了深圳合成生物研究重大科技基礎設施，在研究課題開展過程中，尤其是在單細胞轉錄組建庫前的細胞分選及建庫早期的關鍵步驟中需要使用大量384孔板，合成生物大設施的自動化、高通量平臺發(fā)揮了不可替代的作用。在研究過程中，僅需要兩到三名工作人員在一天內(nèi)就能夠制備上千塊孔板，且每一塊均能夠按照實驗要求添加細胞裂解液和引物，從而保證了實驗的準確性和可重復性。合成生物大設施高效的工作方式使研究工作得到快速推進。研究團隊期待未來能夠繼續(xù)與大設施合作，在合成生物學領域取得更多突破。

參考文獻：

1.Park, M.D., Silvin, A., Ginhoux, F., and Merad, M. (2022). Macrophages in health and disease. Cell 185, 4259-4279.

2.Guilliams, M., Thierry, G.R., Bonnardel, J., and Bajenoff, M. (2020). Establishment and Maintenance of the Macrophage Niche. Immunity 52, 434-451.

3.Mass, E., Ballesteros, I., Farlik, M., Halbritter, F., Gunther, P., Crozet, L., Jacome-Galarza, C.E.,Handler, K., Klughammer, J., Kobayashi, Y., et al. (2016). Specification of tissue-resident macrophages during organogenesis. Science 353