【原】免疫治療在腦損傷中的重要作用

腦聲常談 2023-08-03 發(fā)布于上海

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創(chuàng)傷性腦損傷是死亡的主要原因，先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)在創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)病機制中起著重要的作用，γδ T細胞已被證明在多種不同的條件下影響大腦免疫病理，然而，它們在急性和慢性創(chuàng)傷性腦損傷中的作用在很大程度上尚不清楚。

基于此，2023年7月18日波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院布萊根婦女醫(yī)院安·羅姆尼神經(jīng)疾病中心Howard L. Weiner研究團隊在Nature communications發(fā)表 “Vγ1 and Vγ4 gamma-delta T cells play opposing roles in the immunopathology of traumatic brain injury in males”。揭示了Vγ1和Vγ4-δT細胞在男性創(chuàng)傷性腦損傷的免疫病理學(xué)中發(fā)揮相反的作用。

在這里，作者發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中，γδ T細胞早在損傷后就影響創(chuàng)傷性腦損傷的病理生理。TCRδ?/?小鼠的特點是急性創(chuàng)傷性腦損傷炎癥減少，慢性創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)認知功能改善。發(fā)現(xiàn)Vγ1和Vγ4 γδ T細胞亞群在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮了相反的作用。Vγ4 γδ T細胞浸潤大腦，分泌IFN-γ和IL-17，激活小膠質(zhì)細胞并誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥。然而，Vγ1 γδ T細胞分泌TGF-β，維持小膠質(zhì)細胞的穩(wěn)態(tài)，并在浸潤大腦時抑制創(chuàng)傷性腦損傷。這些發(fā)現(xiàn)為腦損傷后不同γδ T細胞亞群的作用提供了新的見解，并為開發(fā)基于靶向γδ T細胞的TBI治療奠定了基礎(chǔ)。

圖一 γδ T細胞導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷的功能缺陷

為了研究γδ T細胞是否在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮作用，作者采用了使用立體定向電磁沖擊器的創(chuàng)傷性腦損傷控制皮質(zhì)沖擊模型。在TCRδ?/?和年齡匹配的野生型小鼠的右側(cè)頂葉皮層上誘導(dǎo)了中度創(chuàng)傷性腦損傷。腦外傷后7天，腦部蘇木精和伊紅染色顯示，與WT相比，TCRδ?/?小鼠的病變體積顯著減少。還發(fā)現(xiàn)TCRδ?/?組在CCI后第3天的同側(cè)半球腦水腫顯著減少。為了研究γδ T細胞對運動功能的影響，作者進行了轉(zhuǎn)棒試驗，發(fā)現(xiàn)TCRδ?/?小鼠在腦損傷后2周運動功能得到改善。然后利用曠場試驗測試創(chuàng)傷后焦慮，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后1個月，TCRδ?/?小鼠表現(xiàn)出增加探索行為和減少焦慮樣行為，增加速度，增加在中心區(qū)域的總距離和時間。TCRδ?/?小鼠的記憶功能完全恢復(fù)，Morris水迷宮測試試驗中花在目標象限的時間增加，游泳速度增加。然而，用于評估TBI50中強迫行為的埋珠試驗顯示，TCRδ?/?小鼠在創(chuàng)傷后一年的強迫行為增加，這表明γδ T細胞在TBI誘導(dǎo)的強迫行為中發(fā)揮了有益的作用。在分子和行為水平上的不同性別反應(yīng)，作者研究了雌性TCRδ?/?動物是否與雄性動物具有類似的行為神經(jīng)保護。發(fā)現(xiàn)WT-TBI和TCRδ?/?損傷后1個月的雌性小鼠在行為水平上沒有顯著差異。發(fā)現(xiàn)除了焦慮樣行為外，TBI本身對假手術(shù)組和WT-TBI雌性小鼠的小腦功能或記憶沒有顯著影響。這可能是由于女性的急性神經(jīng)炎癥被抑制，這被認為是由雌激素和孕酮的神經(jīng)保護作用驅(qū)動的。進行16 S rRNA測序，證實WT和WT的微生物群不同。TCRδ?/?小鼠的β-多樣性，以及特定細菌的相對豐度。在腸腦軸中被研究充分的細菌之一，被發(fā)現(xiàn)在TCRδ?/?小鼠中富集。嗜粘液阿克曼菌可能發(fā)揮保護作用，也在阿爾茨海默病動物模型和顱內(nèi)出血患者中富集。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)證明了γδ T細胞對創(chuàng)傷后神經(jīng)認知功能的關(guān)鍵作用。

圖二 γδ T細胞驅(qū)動創(chuàng)傷性腦損傷后的急性神經(jīng)炎癥

為了研究γδ T細胞在TBI急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的作用，作者從TCRδ?/?和WT小鼠的大腦中分離了免疫細胞。創(chuàng)傷后2天，TCRδ?/?小鼠顯示CD4+和CD8+T細胞減少。因為已知小膠質(zhì)細胞在TBI后的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用，作者探究了小膠質(zhì)細胞是否受到γδ T細胞缺失的影響，發(fā)現(xiàn)TCRδ?/?小鼠的外周扭轉(zhuǎn)皮質(zhì)中Iba1+小膠質(zhì)細胞的共定位減少，通過Scholl分析，Iba1+小膠質(zhì)細胞的分支增加，表明γδ T細胞在小膠質(zhì)細胞激活中發(fā)揮作用。APP免疫反應(yīng)性增加和Tau磷酸化已被證明是TBI后神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵特征。在TBI后第7天，WT小鼠的APP和p-Tau免疫反應(yīng)性增加，而TCRδ?/?小鼠的APP和p-Tau免疫反應(yīng)性減少。TCRδ?/?小鼠的總RNA裂解液的分析顯示，關(guān)鍵炎癥細胞因子包括Il12a、Il18、Il6、Tnf、Il1b、Ccl2、Il17a、Cxcl10和Ccl5減少，而調(diào)節(jié)性T細胞主轉(zhuǎn)錄因子TCRδ?/?小鼠Foxp3增加。因此，γδ T細胞在創(chuàng)傷性腦損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中發(fā)揮重要作用，并調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫。

圖三 γδ T細胞在急性和慢性創(chuàng)傷性腦損傷中調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞

作者使用實驗室開發(fā)的小膠質(zhì)細胞特異性4D4+抗體，在TBI后獲得了小膠質(zhì)細胞的單細胞懸液。在年輕急性WT-TBI小鼠與年輕WT-假手術(shù)組小鼠分離的小膠質(zhì)細胞中檢測到20,212個表達基因，并發(fā)現(xiàn)2437個差異表達基因?；蚣细患治鲲@示，這些轉(zhuǎn)錄本與炎癥生物學(xué)通路相關(guān)，包括IFN-γ反應(yīng)、凋亡和TNF-α信號通路。與年輕的急性WT-TBI相比，作者在年輕的急性TCRδ?/?TBI小鼠的小膠質(zhì)細胞中檢測到1062個DEGs。在急性創(chuàng)傷性腦損傷中，來自TCRδ?/?小鼠的小膠質(zhì)細胞具有更少的炎癥和更穩(wěn)態(tài)的基因特征。GSEA顯示，在年輕急性TCRδ?/?TBI小鼠分離的小膠質(zhì)細胞中，TNF-α信號通路、凋亡、蛋白分泌、IL-6/JAK/STAT3信號通路和MTORC1信號通路受到抑制。TCRδ?/?TBI小膠質(zhì)細胞中急性通路改變之間的相互作用。作者在老年WT-TBI小鼠與老年WT-假手術(shù)組小鼠的小膠質(zhì)細胞中檢測到1376個差異調(diào)控的差異基因。這些DEGs與包括TGF-β信號通路和減少細胞凋亡在內(nèi)的生物通路的富集相關(guān)。與老年慢性WT-TBI小鼠相比，從老年慢性TCRδ?/?TBI小鼠中分離的小膠質(zhì)細胞中檢測到59個差異表達基因。GSEA分析顯示，與年齡匹配的WT-TBI小鼠相比，分離的老年慢性TCRδ?/?TBI小鼠的基質(zhì)沉積、生長、干細胞增殖、神經(jīng)元投射、軸突發(fā)育、突觸發(fā)生、細胞連接組裝和細胞死亡通路減少的生物通路富集。TCRδ?/?TBI小膠質(zhì)細胞中慢性通路改變之間。APOE和CAMP響應(yīng)元件調(diào)節(jié)器被發(fā)現(xiàn)是慢性TBI發(fā)病機制的主要上游調(diào)控因子，γδ T細胞參與了衰老。這些發(fā)現(xiàn)表明，創(chuàng)傷性腦損傷后的腦浸潤性γδ T細胞誘導(dǎo)了一種小膠質(zhì)細胞促炎表型，這有助于創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)病機制。

圖四 Vγ4細胞可改善TBI的發(fā)病機制

接下來，作者通過在損傷前24小時消耗Vγ1、Vγ4或總γδ T細胞來研究γδ T細胞亞群在急性和慢性創(chuàng)傷性腦損傷中的影響。通過RT-qPCR驗證了γδ T細胞的消耗。在急性創(chuàng)傷性腦損傷中，發(fā)現(xiàn)與pbs處理的小鼠相比，Vγ4缺失的小鼠CD4+和CD8+浸潤T細胞減少，Ly6Chi經(jīng)典單核細胞、CCR2 + CX3CR1+單核細胞和CD45int小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞上MHCII的表達減少。Vγ1缺失的小鼠顯示CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤增加。Vγ4缺失的小鼠顯示出更大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細胞因子包括Il6、Il12、Il18和Tnf的減少，而Vγ1缺失的小鼠的調(diào)節(jié)性細胞因子表達包括Il10和Tgfb。作者還研究了急性創(chuàng)傷性腦損傷患者血腦屏障的完整性，發(fā)現(xiàn)Vγ4缺失的小鼠血腦屏障破裂較少，Vγ4缺失的小鼠在創(chuàng)傷后2周運動協(xié)調(diào)能力改善，后1個月運動活動增加，焦慮行為減少。Vγ1耗盡的小鼠在MWM上顯示出記憶受損，而Vγ4耗盡的小鼠在創(chuàng)傷后1個月記憶得到改善。此外，與從Vγ1耗盡的小鼠中分離的小膠質(zhì)細胞相比，從Vγ4耗盡的TBI小鼠中分離的小膠質(zhì)細胞的炎癥/激活基因Il1b、Cd36、CD74、Ccr2、Cfp、H2-Eb1、Hspa1a、Hspa1b、Ifitm1和Chchd下調(diào)。相反，Vγ1缺失的小鼠體內(nèi)包括Tgfb在內(nèi)的穩(wěn)態(tài)基因下調(diào)。GSEA發(fā)現(xiàn)，從Vγ4耗盡的隊列中分離出來的小膠質(zhì)細胞中，與參與免疫應(yīng)答分子介質(zhì)產(chǎn)生的信號通路相關(guān)的基因表達下調(diào)。因此，由于Vγ4亞群的消耗與總γδ T細胞的消耗表現(xiàn)出相似的神經(jīng)炎癥特征，作者的研究發(fā)現(xiàn)，Vγ4細胞是急性創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)病的主要介質(zhì)。

圖五 Vγ1細胞的過繼轉(zhuǎn)移可改善TBI的發(fā)病機制

為了進一步研究γδ T細胞亞群在急性和慢性創(chuàng)傷性腦損傷中的差異作用，作者將WT小鼠分離的Vγ1或Vγ4 γδ T細胞轉(zhuǎn)移到TCRδ?/?小鼠中。通過RT-qPCR驗證過繼轉(zhuǎn)移的細胞成分。在急性創(chuàng)傷性腦損傷中，接受WT-Vγ1細胞的TCRδ?/?小鼠CD4+和CD8+浸潤T細胞，Ly6Chi和Ly6Citcint單核細胞無差異，但CCR2 + CX3CR1+單核細胞減少。相反，與pbs處理的小鼠相比，接受WT-Vγ4細胞的TCRδ?/?小鼠浸潤T細胞的CD4+增加，實質(zhì)內(nèi)CCR2 + CX3CR1+單核細胞增加，CD45int小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞上的MHCII表達增加。與Vγ4 γδ T細胞相比，Vγ1 γδ T細胞的過繼并導(dǎo)致血腦屏障的分解減少。然后，作者研究了Vγ1 γδ T細胞亞群的過繼轉(zhuǎn)移是否對創(chuàng)傷性腦損傷后的長期神經(jīng)認知缺陷有治療作用。在損傷后24小時和1周，將WT Vγ1或Vγ4 γδ T細胞轉(zhuǎn)移到WT受者中。發(fā)現(xiàn)Vγ1 γδ T細胞改善了創(chuàng)傷后1個月后的運動協(xié)調(diào)，減少了焦慮樣行為。Morris水迷宮測試顯示，小鼠記憶功能得到改善。相反，Vγ4受者的神經(jīng)認知缺陷沒有變化轉(zhuǎn)移降低了急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥細胞因子，增加了Tgfb1的表達。對小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄組的GSEA分析顯示，與先天免疫應(yīng)答相關(guān)的基因表達下調(diào)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明γδ T細胞亞群在創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮著相反的作用。Vγ4 γδ T細胞是有害的，促進神經(jīng)炎癥發(fā)生，而Vγ1 γδ T細胞是有益的，并保護其免受TBI誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。

圖六 Vγ1細胞通過TGF-β改善TBI后的神經(jīng)炎癥

為了研究Vγ1細胞轉(zhuǎn)移對TBI的有益影響是否依賴于Vγ1 γδ T細胞產(chǎn)生的TGF-β，作者首先測量LAP在γδ T細胞亞群上的表達。發(fā)現(xiàn)Vγ1 γδ T細胞比Vγ4表達更多的LAP。發(fā)現(xiàn)從頸部深部淋巴結(jié)和脾臟分離的Vγ1 γδ T細胞在創(chuàng)傷后3天反應(yīng)性產(chǎn)生更多的IFN-γ，然而，Vγ1細胞很少到不分泌IL-17。然后，作者在損傷時將總WTVγ1細胞或WT-Vγ1LAPlo細胞轉(zhuǎn)移到TCRδ?/?受體中，以研究表達lap的Vγ1亞群在急性創(chuàng)傷性腦損傷中的作用。發(fā)現(xiàn)與接受WT-Vγ1LAPlo Vγ1細胞的小鼠相比，TCRδ?/?小鼠接受總WT-Vγ1細胞浸潤CD4+和CD8+減少T細胞減少，Ly6Chi和Ly6Cint單核細胞減少，CX3CR1 + CCR2+單核細胞浸潤減少沒有差異，但CD45int小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的MHCII表達減少。此外，接受總WT-Vγ1細胞的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細胞因子包括Il18、Il1b和Tnf的減少更大。與Vγ1 γδ T細胞和抗TGF-β共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞的RNAseq顯示，小膠質(zhì)細胞激活基因Ccl5、Cx3cr1、Nfkb2、Tnfrsf26和Rock1表達上調(diào)。因此，Vγ1 γδ T細胞通過分泌TGF-β改善急性TBI免疫病理。

圖七 Vγ4細胞通過IL-17和IFN-γ驅(qū)動TBI后的神經(jīng)炎癥

為了進一步研究Vγ4 γδ T細胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-17在TBI中的作用，作者將損傷時從WT、IFN-γ?/?或IL17af?/?小鼠中分離出來的總WT-Vγ4細胞轉(zhuǎn)移到TCRδ?/?受體中。發(fā)現(xiàn)與接受WT-Vγ4細胞的小鼠相比，接受IFN-γ?/?Vγ4細胞的TCRδ?/?小鼠浸潤CD8+T細胞減少，Ly6Chi經(jīng)典單核細胞減少，CD45int小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的MHCII表達減少。雖然這兩種細胞因子都有助于急性腦外傷后神經(jīng)炎癥，但與IL17af?/?Vγ4受體相比，IFN-γ?/?Vγ4受體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細胞因子包括Tnf、Ifng和Il1b的減少更大，從而上調(diào)了Tgfb?？紤]到Vγ4γδ-T細胞導(dǎo)致了小膠質(zhì)細胞的激活作者詢問IL-17和/或IFN-γ是否在急性TBI的Vγ4-小膠質(zhì)細胞串擾中起作用。而小膠質(zhì)細胞分離的TCRδ?/?受者的?/?Vγ4和IFNγ?/?Vγ4細胞顯示穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄譜與接收者總Vγ4 γδ T細胞，IL17af?/?Vγ4接收者最顯著的穩(wěn)態(tài)譜，可能是由于豐富的TGF-β沒有IL-17。IL17af?/?Vγ4細胞的過繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致Sod1、Cd72、Spp1、Ccl12、Cstb、Bad和Hspa1a等基因進一步下調(diào)，同時Cx3cr1和Lrp1的表達增加。在從IL17af?/?Vγ4受體中分離出來的小膠質(zhì)細胞中，與活性氧反應(yīng)相關(guān)的生物途徑相關(guān)的基因被下調(diào)，在IFN-γR1缺陷的小膠質(zhì)細胞中，與細胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因表達下調(diào)。綜上所述，這與作者發(fā)現(xiàn)的γδ T細胞分泌的IFN-γ和IL-17A作為小膠質(zhì)細胞的上游調(diào)控因子相一致。因此，Vγ4 γδ T細胞通過IFN-γ和IL-17激活小膠質(zhì)細胞，參與了TBI的發(fā)病機制。

總之，作者證實了γδ T細胞在急性和慢性創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。而Vγ4-γδ-T細胞通過激活小膠質(zhì)細胞來促進炎癥，Vγ1 γδ T細胞通過促進一個穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細胞信號來改善炎癥。因此，靶向調(diào)節(jié)Vγ4或Vγ1 γδ T細胞是控制神經(jīng)炎癥和減輕腦外傷后神經(jīng)功能缺損的一種潛在治療方法。