大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。

聽力障礙通常與內(nèi)耳發(fā)育不全或損傷有關(guān)，是影響生活質(zhì)量的嚴(yán)重健康問題。因此研究聽覺器官發(fā)生過程中的關(guān)鍵基因?qū)τ谔剿髀犃p傷的潛在策略至關(guān)重要。斑馬魚模型在理解內(nèi)耳發(fā)育不良和相關(guān)疾病的分子遺傳學(xué)原理方面得到了越來越多的應(yīng)用，內(nèi)耳發(fā)育包括遺傳遺傳機制和表觀遺傳機制。

2022年03月29日，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院何英姿團隊和皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院劉少峰團隊合作在《Cell Prolif》雜志發(fā)表題為“Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling”的研究論文，該研究以斑馬魚為實驗?zāi)Ｐ停ㄟ^RNA測序（RNA-seq）、原位雜交（ISH）、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和免疫組化等方法揭示了DNMT1（DNA methyltransferase 1 ，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1）在聽覺系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用。

標(biāo)題：Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling Dnmt1通過細(xì)胞周期阻滯和Fgf信號調(diào)控聽覺器官發(fā)育

時間：2022-03-29

期刊：Cell Proliferation

影響因子：IF 8.755

技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq、ISH等

研究摘要

本研究以斑馬魚為實驗?zāi)Ｐ?，探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1)在聽覺系統(tǒng)發(fā)育中的作用。用嗎啉寡核苷酸(mololino oligonucleotide)誘導(dǎo)Dnmt1缺失，利用RNA-seq、ISH、WGBS和免疫組化等方法研究其形態(tài)學(xué)改變和機制。結(jié)果表明，在斑馬魚發(fā)育中的后側(cè)線（posterior lateral line，pLL）系統(tǒng)中，Dnmt1下調(diào)誘導(dǎo)神經(jīng)丘（neuromasts）數(shù)量減少，并抑制原基細(xì)胞增殖。ISH結(jié)果表明，F(xiàn)gf信號通路被抑制，趨化因子成員cxcr4b、cxcr7b和cxcl12a表達(dá)受到干擾，而lef1表達(dá)在抑制Dnmt1后增加。此外，Dnmt1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致耳石畸形和半規(guī)管畸形，胞囊（utricle）和球囊（saccule）的毛細(xì)胞（hair cell，HC）分化受到嚴(yán)重抑制。當(dāng)Dnmt1表達(dá)下調(diào)時，耳基板標(biāo)志物pax2/5和fgf3/8/10的原位染色減少。WGBS分析表明全基因組甲基化水平顯著下調(diào)，其中細(xì)胞周期基因在Dnmt1實驗組和對照組之間的表達(dá)差異最大。進一步的ISH分析證實了RNA-seq和WGBS實驗結(jié)果，cdkn1a和tp53在Dnmt1敲除后均上調(diào)。本研究結(jié)果表明，Dnmt1通過調(diào)控細(xì)胞周期基因以及Wnt和Fgf信號通路對斑馬魚聽覺器官的發(fā)育至關(guān)重要。

研究方法：

（1）全胚原位雜交(whole mount In situ hybridization, WISH)技術(shù)檢測了Dnmt1在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的時空特異性表達(dá)模式。Dnmt1在眼、內(nèi)耳和側(cè)線系統(tǒng)中的強表達(dá)模式表明，Dnmt1在這些器官的發(fā)育和分化中至關(guān)重要。

（2）通過斑馬魚的胚胎顯微注射Morpholinos方法下調(diào)Dnmt1表達(dá)，結(jié)果表明與對照組相比，Dnmt1- MO胚胎表現(xiàn)出一定程度的發(fā)育遲緩和畸形，包括耳石器官異常、半規(guī)管畸形和側(cè)線系統(tǒng)神經(jīng)丘數(shù)量減少。

（3）通過ISH、 RNA-seq和WGBS分析結(jié)果表明，Dnmt1通過調(diào)控耳囊泡(OV)特異性基因、FGF信號通路和細(xì)胞周期信號通路來調(diào)控斑馬魚聽覺器官的發(fā)育。

結(jié)果圖形

（1）Dnmt1在斑馬魚內(nèi)耳和神經(jīng)丘中的表達(dá)

圖1：Dnmt1為斑馬魚內(nèi)耳和pLL發(fā)育所必需。

WISH染色描繪了Dnmt1在2-cell期（two-cell stage）（a）、oblong期（B）、胚盾期(shield stage)（C）、體節(jié)期(segmentation period)（D:側(cè)視圖，E:背視圖，F(xiàn):12hpf時的腹視圖，G:20hpf時d 側(cè)視圖）的持續(xù)表達(dá)。Dnmt1高表達(dá)水平富集在26-48hpf的遷移原基（H和I）、頭部區(qū)域的內(nèi)耳和后側(cè)線（J）的沉積神經(jīng)丘上。原基（primordium）（I1）、內(nèi)耳（inner ear）（J1）和神經(jīng)丘（neuromast）（J2）結(jié)構(gòu)的放大倍數(shù)圖像表明Dnmt1高表達(dá)。

（2）Dnmt1為側(cè)線神經(jīng)丘（lateral line neuromasts）沉積所必需

圖2：敲除Dnmt1后，Dnmt1表達(dá)顯著下調(diào)。

A-F：與對照組相比，Dnmt1-MO胚胎中Dnmt1原位染色在不同時期WISH均下調(diào)。黑色虛線分別表示48 hpf時的耳囊泡（A,C）和神經(jīng)丘（B,D）。E-F中的黑色虛線表示32 hpf時的原基。

G-H：Dnmt1 morpholino注射后，Dnmt1的蛋白印跡在條帶強度（G）和定量分析（H）中均顯著降低。

圖3：Dnmt1是斑馬魚后側(cè)線神經(jīng)丘沉積所必需的。

A-B. 48 hpf時，野生型胚胎和Dnmt1缺失型胚胎的大體形態(tài)。

D-E. 與對照組（D）相比，Dnmt1突變體（E）在側(cè)線神經(jīng)丘的eya1染色中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)丘數(shù)量減少和神經(jīng)丘之間的距離延長。

G-H. 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系cldnb:lynGFP證實了在WISH中觀察到的結(jié)果。

C、F、I. 在mRNA組和MO聯(lián)合注射組中成功挽救了形態(tài)學(xué)、eya1染色和綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)丘。

（3）抑制Dnmt1表達(dá)可顯著抑制PLL細(xì)胞增殖

圖4： Dnmt1下調(diào)在原基遷移和神經(jīng)丘形成過程中抑制細(xì)胞增殖。

A-L. 對照胚胎和Dnmt1缺失突變體之間BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞數(shù)量比較代表性圖像

M-N. 對照組胚胎(n=32)和Dnmt1-MO胚胎(n=31)的BrdU指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（4）DNMT1通過調(diào)節(jié)Fgf、Wnt和趨化因子信號通路調(diào)控PLL發(fā)育

圖5：Dnmt1缺失抑制斑馬魚原基中的Fgf信號和趨化因子超家族。

（5）斑馬魚Dnmt1基因敲除導(dǎo)致嚴(yán)重的耳畸形

圖6：敲除Dnmt1會破壞半規(guī)管和耳石器官的正常發(fā)育

圖7：Dnmt1抑制影響HC在胞囊和球囊中的分化。

（6）Dnmt1通過調(diào)控pax家族和Fgf信號通路參與斑馬魚內(nèi)耳胚胎發(fā)生

圖8：Dnmt1敲除后耳板編碼標(biāo)記基因表達(dá)變化

（7）Dnmt1在斑馬魚發(fā)育過程中調(diào)控cdkn1a和tp53的轉(zhuǎn)錄水平

圖9：RNA-seq分析揭示細(xì)胞周期基因是斑馬魚耳發(fā)育過程中Dnmt1抑制的關(guān)鍵調(diào)控因子。

1. 火山圖分析顯示了這兩組的所有DEG。

2. Venn圖進一步標(biāo)記了Con-MO和Dnmt1-MO組中唯一和重疊DEG數(shù)量。

3. KEGG富集分析顯示，Dnmt1敲除樣品和對照組之間的前20個信號通路存在統(tǒng)計學(xué)差異。

4. 兩組的細(xì)胞周期通路DEG聚類分析。

5. ISH數(shù)據(jù)證實，與對照組相比，48 hpf時敲除Dnmt1后cdkn1a（p21）和tp53均上調(diào)

圖10：WGBS分析檢測Dnmt1敲除后的全基因組低甲基化。

1. 小提琴圖顯示具有三個生物學(xué)重復(fù)的Con-MO組和Dnmt1-MO組的整體甲基化水平。白點表示中值，黑色實框表示四分位距（interquartile range, IQR），細(xì)黑線表示數(shù)據(jù)范圍，小提琴的寬度表示分布密度。

B-C. 與Con-MO組相比，Dnmt1-MO組中低甲基化（B）和高甲基化（C）的DMR數(shù)量。橫坐標(biāo)表示不同的甲基化水平。

D. Circos圖顯示與Con-MO組相比，基因組Dnmt1-MO組中DEG和DMR的總體分布。從外圈到內(nèi)圈分別表示染色體數(shù)目、DEG（RNA-Seq）和DMR（CpG）。紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)；顏色越深，差異越大。

E. 熱圖顯示與Con-MO組相比，Dnmt1-MO組共有的DEG和DMR相關(guān)基因。紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)。

F-G. 與Con-MO組相比，Dnmt1-MO突變體功能區(qū)中tp53和cdkn1a的甲基化水平均顯著降低。TES轉(zhuǎn)錄終止位點；TSS轉(zhuǎn)錄起始位點。

關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術(shù)

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因提供的全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。

應(yīng)用方向：

WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關(guān)鍵位點）

• 全基因組甲基化圖譜課題

• 標(biāo)志物篩選課題

• 小規(guī)模研究課題

技術(shù)優(yōu)勢：

• 應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；

• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；

• 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻(xiàn)：Tang D, Zheng S, Zheng Z, Liu C, Zhang J, Yan R, Wu C, Zuo N, Wu L, Xu H, Liu S, He Y. Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling. Cell Prolif. 2022 May;55(5):e13225.

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