CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌中普遍存在的抗病毒防御系統(tǒng)，2012年6月28日，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier 在 Science 期刊發(fā)表論文，揭示了CRISPR-Cas9的作用機(jī)制，并指出了其作為基因組編輯工具的潛力。此后，在張鋒、George Church、劉如謙等人的進(jìn)一步推動下，CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)得到了快速發(fā)展。

如今，CRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛用作分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室工具，并在基因功能研究、藥物靶點(diǎn)篩選、遺傳疾病治療、作物育種等領(lǐng)域取得了突破性成就。此外，CRISPR-Cas系統(tǒng)還被用于修飾改造細(xì)胞療法（例如CAR-T細(xì)胞療法），然而，對原代細(xì)胞進(jìn)行CRISPR-Cas基因編輯仍面臨著很大挑戰(zhàn)。其中一個重要原因是，缺乏能夠高效且低毒性的方法讓CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)入原代細(xì)胞并發(fā)揮作用。

目前常用的CRISPR-Cas系統(tǒng)的遞送方法主要有病毒轉(zhuǎn)染和電穿孔（電轉(zhuǎn)染）。病毒轉(zhuǎn)染存在著病毒基因和宿主基因整合的風(fēng)險，并且對于分子量相對較大的Cas蛋白轉(zhuǎn)染效率低下；電穿孔雖然可以高效遞送CRISPR-Cas系統(tǒng)，但對細(xì)胞的損傷很大，會干擾細(xì)胞正常的轉(zhuǎn)錄水平和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且電穿孔需要借助特殊的儀器及試劑，這大大增加了基因編輯的成本。因此，建立針對原代細(xì)胞的高效、安全、簡易的基因編輯系統(tǒng)具有重要意義。

近日，賓夕法尼亞大學(xué)的史俊煒、Shelley L. Berger 和 E. John Wherry 團(tuán)隊（第一作者張珍博士）在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing 的研究論文。

該研究開發(fā)了名為多肽輔助的基因編輯（Peptide-Assisted Genome Editing，PAGE）新方法，PAGE系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對人類原代細(xì)胞的更高效、更快速且更低毒性的基因組編輯。

PAGE系統(tǒng)為下一代細(xì)胞療法和基因療法的開發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，有望書寫癌癥及遺傳疾病治療發(fā)展的新篇章。

在這項研究中，研究團(tuán)隊探索了使用病毒來源的小蛋白質(zhì)片段（多肽）來更有效地引導(dǎo)CRISPR-Cas分子穿過人類原代細(xì)胞的細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞核。

具體來說，該研究發(fā)現(xiàn)，將來自HIV轉(zhuǎn)錄反式激活因子（TAT）的細(xì)胞穿膜肽和來自甲型流感病毒血凝素（HA2）的內(nèi)體逃逸輔助肽形成融合肽TAT-HA2，將其與CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)合，TAT-HA2能夠促進(jìn)CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)入人類和小鼠的原代細(xì)胞及其細(xì)胞核。

研究團(tuán)隊將該系統(tǒng)命名為多肽輔助基因編輯系統(tǒng)（Peptide-Assisted Genome Editing, PAGE）。該系統(tǒng)包括了具有細(xì)胞穿透性的Cas9或Cas12a蛋白，以及幫助Cas蛋白從內(nèi)體逃逸的輔助肽TAT-HA2（圖1）。

PAGE系統(tǒng)只需與原代細(xì)胞共孵育30分鐘，便可實(shí)現(xiàn)對人和小鼠T細(xì)胞以及人造血干祖細(xì)胞的高效基因編輯。同時，與電穿孔方法相比，PAGE對原代細(xì)胞的損傷很小，并且不影響細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。因此，PAGE對原代細(xì)胞的基因編輯具有劃時代的意義，也為將來廣泛的臨床應(yīng)用提供可能。

史俊煒教授（左），張珍博士（右）

論文第一作者張珍博士對《生物世界》表示，相對于傳統(tǒng)CRISPR-Cas遞送系統(tǒng)，PAGE具有以下幾點(diǎn)顯著優(yōu)勢：

1、安全、高效、簡便、經(jīng)濟(jì)。首先PAGE不借助病毒轉(zhuǎn)染，所以降低了病毒基因和宿主基因整合的風(fēng)險；其次，PAGE對單基因編輯效率高達(dá)98%（圖2），對三基因編輯效率高達(dá)88%（圖3），并且編輯過程只需要30分鐘；此外，輔助肽合成價格低廉，細(xì)胞穿透性的Cas蛋白與普通Cas蛋白的純化工藝相仿，所以PAGE的使用門檻很低。

2、可用于多種原代細(xì)胞的基因編輯。PAGE除高效編輯人和小鼠的原代T細(xì)胞外，還可以高效編輯人造血干/祖細(xì)胞（圖4），為基因治療的推廣提供可靠的技術(shù)支持。

3、對細(xì)胞毒性小，不影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平。與電穿孔方法相比，經(jīng)PAGE處理過的CAR T細(xì)胞，活細(xì)胞比例達(dá)95%以上，而經(jīng)電穿孔處理的細(xì)胞只有65%左右（圖5），因此PAGE會大幅節(jié)省CAR-T細(xì)胞的體外培養(yǎng)成本；另外同對照相比，PAGE處理過6小時后的CAR-T細(xì)胞無差異性基因表達(dá)，電穿孔有近2000個差異基因表達(dá)（圖6）。

4、使用形式多樣，可滿足基礎(chǔ)研究及臨床治療的不同需求。PAGE既可以直接遞送Cas蛋白，也可以遞送核糖核酸蛋白復(fù)合體（RNP）（圖7），此外PAGE既可用于CRISPR-Cas9系統(tǒng)也可用于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)。

除了在細(xì)胞療法和基因療法方面的潛在用途外，PAGE系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域也有著廣泛應(yīng)用前景。目前標(biāo)準(zhǔn)的CRISPR-Cas系統(tǒng)向細(xì)胞遞送的效率低下，這意味著通過基因編輯來創(chuàng)建疾病小鼠模型通常是一個多步驟且耗時的過程，而高效、低毒性的PAGE系統(tǒng)有望簡化、加速疾病小鼠模型的構(gòu)建。

綜上所述，PAGE對原代細(xì)胞進(jìn)行基因編輯具有常規(guī)方法所無法比擬的優(yōu)勢。PAGE基因編輯系統(tǒng)高效、安全、低創(chuàng)、簡便以及其在基礎(chǔ)研究和臨床治療的廣泛應(yīng)用前景，為將來基因編輯翻開嶄新的一頁（PAGE）。