近年來(lái)，創(chuàng)新的免疫療法為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供了新的策略。與傳統(tǒng)的化學(xué)療法不同，將T細(xì)胞通過(guò)基因工程改造，使它們能特異性對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，與之相關(guān)的成功案例令人震驚。然而，仍有許多問(wèn)題——包括療效不足、自體來(lái)源不足、副作用大、價(jià)格高——從而限制了臨床上的使用。

CAR-NK細(xì)胞是一個(gè)有希望的替代方案，它具有獨(dú)特的細(xì)胞毒性和最小的移植物抗宿主病風(fēng)險(xiǎn)。在本文中，我們回顧了CAR-NK 細(xì)胞領(lǐng)域的可能來(lái)源、開發(fā)技術(shù)、潛在優(yōu)勢(shì)和面臨的挑戰(zhàn)。

嵌合抗原受體工程 T 細(xì)胞 (CAR-T) 的免疫療法徹底改變了復(fù)發(fā)/難治性 B 細(xì)胞惡性腫瘤的治療范式。但盡管如此，自體T 細(xì)胞的使用仍具有一定的局限性，包括收集的效應(yīng)T細(xì)胞質(zhì)量的異質(zhì)性、細(xì)胞處理時(shí)間較長(zhǎng)、可用的CAR細(xì)胞數(shù)量有限、以及成本高。

考慮到在單倍體造血干細(xì)胞移植和針對(duì)實(shí)體瘤及血液惡性腫瘤的過(guò)繼性細(xì)胞療法中的抗腫瘤作用，NK細(xì)胞可能是一種有前途的替代品。NK細(xì)胞有不同來(lái)源，可通過(guò)臍帶血、外周血和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)獲得。它們最大的優(yōu)勢(shì)是可以同種異體應(yīng)用而不會(huì)產(chǎn)生重大的毒副作用。然而，大多數(shù)關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的報(bào)告都處在臨床前或早期臨床試驗(yàn)階段。事實(shí)上，NK細(xì)胞可能更難以設(shè)計(jì)，需要優(yōu)化擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染方案，使其標(biāo)準(zhǔn)化。此外，它們?cè)谳斪⒑蟮寞熜У某志眯砸彩且粋€(gè)難題。

隨著利用其細(xì)胞溶解能力、抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC) 和細(xì)胞因子誘導(dǎo)制造CAR-NK細(xì)胞的最新進(jìn)展，“現(xiàn)貨”同種異體CAR-NK細(xì)胞有望在癌癥治療中大放異彩。

自然殺傷 (NK) 細(xì)胞是一種特定類型的淋巴細(xì)胞，被認(rèn)為是先天免疫的一部分，占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%至15%。它們?cè)趷盒约?xì)胞和病毒感染細(xì)胞的免疫監(jiān)視中起著至關(guān)重要的作用 [1]。NK 細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞毒性發(fā)揮作用：通過(guò)分泌穿孔素/顆粒酶以產(chǎn)生“天然”的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及 FasL（Fas 受體的配體，或CD95，腫瘤壞死因子）或TRAIL等因子的表達(dá)(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)，通過(guò)激活死亡受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；還有由 Fc 受體 CD16 (FcγRIII) 介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)。

此外，NK細(xì)胞產(chǎn)生許多細(xì)胞因子，最顯著的是干擾素γ和TNFα。由于其卓越的裂解能力，以一種不依賴抗原的方式進(jìn)行預(yù)激活，所以引起不良反應(yīng)的概率較低。事實(shí)上，NK細(xì)胞的活性是由激活和抑制信號(hào)的復(fù)雜整合來(lái)調(diào)節(jié)的——是它們表面上的眾多受體與靶細(xì)胞表面上的不同配體之間相互作用的總和（圖1）。

NK細(xì)胞有兩個(gè)亞群組成，CD56 dim 和 CD56 bright NK 細(xì)胞，由其CD56的表達(dá)強(qiáng)度而定義。CD56 dim細(xì)胞約占血液NK細(xì)胞的90%，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，主要表達(dá)CD16。CD56 bright NK 細(xì)胞占循環(huán)血液中NK細(xì)胞的 10%，但主要存在于淋巴結(jié)和一些其他器官中，它們的CD16表達(dá)較低，細(xì)胞毒性能力低于 CD56 dim，但具有強(qiáng)大的增殖潛力。這些特性和功能上的差異對(duì)于增強(qiáng)NK細(xì)胞在細(xì)胞治療中的使用和操作非常重要。

圖1. NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性：激活和抑制之間的平衡。

無(wú)論使用何種化療或放療方案，許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤僅靠化療和放療仍是無(wú)法治愈的。同種異體造血干細(xì)胞移植（HSCT）是當(dāng)今大量血液癌癥的唯一治愈選擇。在同種異體HSCT中，主要目標(biāo)是用同種異體供體的正常造血功能對(duì)患者的免疫系統(tǒng)進(jìn)行代替。供體對(duì)受體的免疫系統(tǒng)反應(yīng)稱為移植反應(yīng)。這種反應(yīng)，簡(jiǎn)稱 GvL，表示移植物抗白血病/淋巴瘤，能夠消除患者體內(nèi)殘留的惡性細(xì)胞，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)控制血液惡性腫瘤。這種理論上理想的解決方案的主要挫折是嚴(yán)重的副作用：移植物抗宿主病（GVHD）。供體的免疫系統(tǒng)——本質(zhì)上是同種異體反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞——攻擊宿主的健康組織（尤其是皮膚、消化道、肝臟和肺，但任何器官都可能受到影響）。為了限制嚴(yán)重 GVHD 的風(fēng)險(xiǎn)，大多數(shù)同種異體 HSCT 是由 HLA 相同的供體進(jìn)行的，因此供體和受體之間的 HLA 需完全匹配。

在這種特殊情況下，可以考慮激活來(lái)自供體的單倍體NK細(xì)胞。事實(shí)上，受體白血病細(xì)胞表面的某些I類HLA分子（=KIR配體）可能不被供體NK細(xì)胞上的抑制性KIR受體識(shí)別。這種現(xiàn)象被稱為 GVL NK效應(yīng)，由 KIR/KIR配體錯(cuò)配介導(dǎo)。

這一概念已在先前的研究中報(bào)道，通過(guò)這種錯(cuò)配來(lái)發(fā)揮抗白血病作用，尤其是在 AML 環(huán)境中移植了半相合供體的患者中[7,8]。然而，同種異體 HSCT 后同種異體反應(yīng)性 NK 細(xì)胞的這種抗白血病作用是有爭(zhēng)議的，一些研究顯示出相互矛盾的結(jié)果。毫無(wú)疑問(wèn)，具有重要可塑性的 NK 細(xì)胞會(huì)適應(yīng)其環(huán)境或存在移植后成熟延遲，從而降低其效力和細(xì)胞毒性 [9,10]。盡管如此，即使NK細(xì)胞的體內(nèi)作用不如T細(xì)胞的作用那樣得到了充分證明，但自1990年代后期以來(lái)，半相合HSCT的發(fā)展有助于闡明這一特定淋巴細(xì)胞群，并進(jìn)一步利用它具有巨大的抗腫瘤細(xì)胞毒性的潛力 [11,12]。

迄今為止，同種異體 HSCT 是最古老和最常用的抗白血病免疫療法。然而，它確實(shí)構(gòu)成了一種激進(jìn)的（接受者的免疫系統(tǒng)被破壞并被捐贈(zèng)者的免疫系統(tǒng)取代）、非特異性、非靶向免疫療法，這解釋了它的主要毒性——尤其是GVHD風(fēng)險(xiǎn)，在中斷細(xì)胞移植后數(shù)月或數(shù)年對(duì)患者的免疫系統(tǒng)仍有持續(xù)影響。嵌合抗原受體 (CAR) T 細(xì)胞的發(fā)展以前所未有的方式徹底改變了細(xì)胞抗腫瘤免疫療法 [13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19]。

CAR是一種將常規(guī)T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)基因工程改造以表達(dá)靶向抗原的特定受體。這種嵌合受體由能夠特異性識(shí)別靶細(xì)胞上抗原的免疫球蛋白 (scFy) 的細(xì)胞外單鏈可變片段、跨膜結(jié)構(gòu)域和用于信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，由細(xì)胞質(zhì) CD3ζ 信號(hào)傳導(dǎo)組成使 CAR 的激活獨(dú)立于 pMHC（第一代 CAR）的結(jié)構(gòu)域，其中注入 CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)（第二代CAR），或結(jié)合兩者（第三代 CAR）或與另一個(gè)轉(zhuǎn)基因相關(guān)的單個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域以提高細(xì)胞因子的表達(dá)，從而促進(jìn) CAR-T 細(xì)胞效應(yīng)器能力（第四代）。EMA（歐洲食品與藥品監(jiān)督管理局） 已批準(zhǔn)在R/R DLBCL[20] 中使用axicabtagene ciloleucel和 tisagenlecleucel，以及在患有B-ALL的年輕成人中使用 tisagenlecleucel。其他自體抗CD19或抗BCMA CAR-T細(xì)胞可早期用于成人ALL、濾泡性NHL和骨髓瘤。

通過(guò)這些創(chuàng)新的新療法，可以觀察到40-60%的患者的長(zhǎng)期反應(yīng)，這些患者的中位總生存期通常約為6個(gè)月，從而徹底改變了這些難治復(fù)發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療格局 [21 , 22 , 23]。然而，CAR-T療法在使用上仍面臨諸多障礙和實(shí)際問(wèn)題[24]。

（1）CAR-T細(xì)胞是從患者自身的自體細(xì)胞發(fā)展而來(lái)的，在淋巴采血過(guò)程中收集到的T淋巴細(xì)胞的質(zhì)量以及獲得的產(chǎn)品的異質(zhì)性（如效應(yīng)能力、活力、擴(kuò)增能力、T細(xì)胞衰老和耗竭），本質(zhì)上是由之前的治療引起的，也是患者的免疫系統(tǒng)狀態(tài)所致；

（2）從收集到生產(chǎn)過(guò)程的這些障礙使制造過(guò)程費(fèi)力、漫長(zhǎng)且非常昂貴；如今，在美國(guó)，單個(gè)B 細(xì)胞淋巴瘤患者的 CAR-T 細(xì)胞治療費(fèi)用平均為 373,000 美元。Prime Therapeutics 使用真實(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行的一項(xiàng)新研究發(fā)現(xiàn)，總成本平均超過(guò) 700,000 美元，在某些情況下，CAR-T移植后續(xù)費(fèi)用可能超過(guò) 100 萬(wàn)美元。在法國(guó)，在社會(huì)保險(xiǎn)涵蓋CAR—T手術(shù)的全部費(fèi)用的情況下，CAR-T 治療的價(jià)格約為 350,000 歐元，不包括住院和輔助治療的價(jià)格。CAR-T 細(xì)胞的生產(chǎn)和輸注之間的延遲可能達(dá)到2個(gè)月，這對(duì)于患有難治性不受控制的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者來(lái)說(shuō)太長(zhǎng)了。

（3）此外，注射的抗CD19 CAR-T細(xì)胞有其自身的毒性造成的副作用——最常見的是炎癥與細(xì)胞因子釋放綜合征 (CRS) 或神經(jīng)和血液損傷（例如，血細(xì)胞減少癥，有時(shí)可能持續(xù)存在）的發(fā)展有關(guān)。最后，CAR-T治療后抗原靶點(diǎn)的丟失是一個(gè)重要的復(fù)發(fā)原因，尤其是在CD19 B ALL中[25]。

其他基因改造——例如TCR抑制或引入自殺基因——是必要的；一些研究人員甚至嘗試使用沒(méi)有排斥或GVHD的雙陰性CAR-T 細(xì)胞 (CD4-CD8-) [26]。一些臨床研究正在進(jìn)行中，以測(cè)試這些同種異體CAR-T 細(xì)胞（主要用于 B 型惡性腫瘤）與通常的氟達(dá)拉濱-環(huán)磷酰胺 (FluCy) 淋巴耗竭，其中添加了阿侖單抗以降低免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。該工藝增加了CAR的毒性特征，卻隨之增加了免疫抑制甚至長(zhǎng)期發(fā)育不全的風(fēng)險(xiǎn)。在 UCART19 小組最近的一項(xiàng)試驗(yàn)中，在使用或不使用阿侖單抗的FluCy調(diào)理后，將基因組編輯的、供體來(lái)源的同種異體抗CD19 CAR-T細(xì)胞給予患有難治性 B-ALL的成人和兒童。只有接受阿侖單抗的患者表現(xiàn)出擴(kuò)張和抗白血病活性，輸注后28天的CR率為67%，但主要代價(jià)是高毒性[27]。今天，同種異體CAR-T細(xì)胞最常見的用途是作為同種異體 HSCT 的橋接——尤其是在AML和髓系腫瘤中。

NK細(xì)胞的活性完全獨(dú)立于抗原和HLA；它們可以從不相關(guān)的同種異體HLA不相容的供體中獲得。供體NK細(xì)胞和受體腫瘤細(xì)胞之間的這種HLA不相容性可通過(guò) KIR/KIR 配體錯(cuò)配促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤同種異體反應(yīng)（見第1節(jié)）。有趣的是，與同種異體T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不會(huì)引起任何GVHD。這種現(xiàn)象的原因尚不完全清楚，但激活劑受體可能是關(guān)鍵。健康的非應(yīng)激（例如，皮膚、消化道）宿主組織在其表面上不存在應(yīng)激誘導(dǎo)的配體，從而使它們免受NK細(xì)胞毒性的影響。在 HLA不相容的小鼠HSCT模型中，供體NK細(xì)胞甚至通過(guò)破壞受體的抗原呈遞細(xì)胞對(duì)GVHD發(fā)揮保護(hù)作用。這種對(duì)接受者免疫系統(tǒng)的影響可以促進(jìn)移植并使同種異體NK細(xì)胞不易受到免疫排斥的影響。

“現(xiàn)貨”的同種異體NK細(xì)胞在從實(shí)驗(yàn)室到床旁的效率，以及成本方面呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì) [24 , 28 , 29] (表1 )。盡管CAR-NK細(xì)胞具有所有這些優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些局限。

（1）首先，它們?cè)隗w內(nèi)的存活時(shí)間相對(duì)較短，約為1-4周。在難治性AML患者的家族性半相合供體的短期（12-16 小時(shí)）IL-2 激活 CD3-CD56+NK細(xì)胞的臨床試驗(yàn)中，表明用氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺清除淋巴對(duì)NK細(xì)胞的擴(kuò)增至關(guān)重要，并且IL-15的存在是擴(kuò)增和臨床反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素 [30]。NK細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增也需要體內(nèi)施用IL-2，具有顯著的毒性作用。在CAR-NK細(xì)胞的構(gòu)建中加入細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因（如 IL-2 和 IL-15）具有改善擴(kuò)增效率和持久性的潛力 [28]。

（2）其次，血液中數(shù)量有限的NK細(xì)胞需要離體擴(kuò)增技術(shù)，以便在收獲后使用單采術(shù)獲得必要的劑量。已經(jīng)研究了用于離體擴(kuò)增和激活NK細(xì)胞的不同方法。這些方法包括用細(xì)胞因子（主要是 IL15 和 IL2）培養(yǎng)數(shù)天（通常為14 天）。IL-2是必不可少的，目前用于促進(jìn)同種異體NK細(xì)胞遞送后的NK細(xì)胞擴(kuò)增，而IL-15在NK細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)平衡中起關(guān)鍵作用。一些報(bào)道中使用飼養(yǎng)細(xì)胞如Jurkat T淋巴母細(xì)胞或Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞系 (EBV-LCL) 大規(guī)模擴(kuò)增NK細(xì)胞。K562 是一種白血病細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)基因改造，可表達(dá)膜結(jié)合形式的IL-15和4-1BB(CD137L)。最近，K562 細(xì)胞已被設(shè)計(jì)為表達(dá)膜結(jié)合的IL-21和CD137L，展示了一些有趣的結(jié)果。

關(guān)于哪種方法最適合NK 細(xì)胞的高效擴(kuò)增仍然存在爭(zhēng)議，有研究發(fā)現(xiàn)K562飼養(yǎng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)強(qiáng)勁和持續(xù)的增殖（培養(yǎng)3至5周后擴(kuò)增100至 >10,000倍）[31]。

（3）第三，NK細(xì)胞改造有一定難度，對(duì)細(xì)胞凋亡高度敏感且基因表達(dá)水平低。目前，將基因引入NK細(xì)胞的最成功的替代方法是通過(guò)電穿孔快速瞬時(shí)表達(dá)，或通過(guò)病毒載體持續(xù)但低表達(dá)。因此，轉(zhuǎn)染方案的優(yōu)化仍然是開發(fā)CAR-NK療法的一個(gè)重要因素 [32]。最近，在離體擴(kuò)增環(huán)境中對(duì)原代人自然殺傷細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行了改進(jìn)。優(yōu)化基因工程N(yùn)K細(xì)胞方法將促進(jìn)CAR-NK細(xì)胞的廣泛應(yīng)用 [33]。

（4）最后，腫瘤微環(huán)境 (TME) 降低了血液惡性腫瘤中NK細(xì)胞的代謝活性，構(gòu)成了增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤作用的重要障礙[34,35]。與摻入IL-15的方式相同，使用編碼趨化因子受體的轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)CAR-NK在腫瘤部位的運(yùn)輸。與抗PD1/抗PDL1等檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用有助于克服TME的抑制作用，從而釋放CAR-NK細(xì)胞的全部潛力。這種效果在小鼠模型的臨床前研究中似乎是成功的，但仍需要在患者的臨床研究中得到證明 [36 ,37,38]。還需要注意的是，關(guān)于被CAR細(xì)胞阻斷的檢查點(diǎn)的大部分?jǐn)?shù)據(jù)都來(lái)自CAR-T細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，而對(duì)CAR-NK細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)很少。

自體 CAR-T 細(xì)胞和同種異體 CAR-NK 細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)比較

同種異體CAR-NK細(xì)胞的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是隨用隨取，這依賴于良好的凍存工藝，隨后才有可能從特定的細(xì)胞源產(chǎn)生大量的同質(zhì)批次。許多NK細(xì)胞來(lái)源已被用于生產(chǎn)同種異體CAR-NK細(xì)胞。

NK-92細(xì)胞系

NK-92是一種白細(xì)胞介素2依賴性、EBV 陽(yáng)性自然殺傷細(xì)胞系，來(lái)源于一名患有快速進(jìn)展性非霍奇金淋巴瘤的 50 歲白人男性的外周血單核細(xì)胞，它們具有高度細(xì)胞毒性。它們的表型包括激活受體 NKp30、NKp46和NKG2D。有趣的是，NK-92表面上唯一的抑制性受體由 ILT2、CD94-NKG2A（識(shí)別HLA-E）和表達(dá)水平較低的抑制性KIR受體KIR2DL4代表。它們的使用非常方便，因?yàn)槔碚撋峡梢耘可a(chǎn)和“無(wú)限”生成CAR-NK細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量、時(shí)間和成本方面都有巨大的收益。不過(guò)由于它們的腫瘤性質(zhì)，這些源自NK-92細(xì)胞系的CAR-NK細(xì)胞需要在注射前進(jìn)行照射，從而改變它們的壽命和分裂。盡管受到照射，它們似乎保留了它們的細(xì)胞毒能力，但它們的體內(nèi)增殖能力發(fā)生了急劇變化，注射后7天內(nèi)消失，需要多次注射。

在三名淋巴清除化療后復(fù)發(fā)和難治性AML患者中，已經(jīng)報(bào)道了在人類患者中使用CAR-NK細(xì)胞的一些證據(jù)，這些患者的 CD33-CAR-NK 細(xì)胞來(lái)源于 NK-92細(xì)胞系[39]。這三名患者接受了挽救性化療，然后以增加的劑量注入抗 CD33 CAR-NK細(xì)胞（每位患者使用三個(gè)遞增劑量的輻照 CAR-NK-92細(xì)胞）。每名患者安全應(yīng)用多達(dá) 5×109個(gè) CD33-CAR-NK 細(xì)胞，沒(méi)有明顯的副作用或3-4級(jí)毒性；只報(bào)告了短暫的發(fā)燒。然而，即使治療耐受性良好并且重復(fù)輸注的安全性得到證實(shí)，所獲得的療效反應(yīng)也非常短暫，一名患者只有10天，另一名患者最多4個(gè)月 [39]。

在體外，慢病毒CD33-CAR載體在NK-92細(xì)胞中的效率遠(yuǎn)高于90%，但細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，與親代NK-92細(xì)胞相比，對(duì)人 HL-60早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系的細(xì)胞毒性適度增強(qiáng)[39]。CAR-NK-92細(xì)胞也已針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行了探索。江等人報(bào)道了用抗 CD38 轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞在體外以及在異種移植 NOD-SCID 小鼠模型中，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系和原發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性 [40]，用表達(dá)抗 CS1/SLAMF7 CAR的NK-92 細(xì)胞觀察到類似的結(jié)果 [41]。

為了提高源自NK-92細(xì)胞系的CAR-NK細(xì)胞的效率，最初用于T 細(xì)胞的第4代CAR在一個(gè)名為 UniCAR 的平臺(tái)上生產(chǎn)。UniCAR 系統(tǒng)由兩個(gè)元素組成：

（i）針對(duì)肽表位 E5B9 的 CAR-NKG2——一種非天然在細(xì)胞表面表達(dá)的抗原；

(ii) 稱為目標(biāo)模塊 (TM) 的雙特異性組件。這種雙特異性模塊在一側(cè)表達(dá) E5B9 抗原，另一側(cè)表達(dá)對(duì)腫瘤抗原特異的抗體（圖 2）。該構(gòu)建體使 CAR-NKG2 細(xì)胞（通過(guò)E5B9抗原）和靶細(xì)胞（通過(guò)特異性抗體）之間能夠接觸。除此之外，效果可以立即停止（開/關(guān)效果），因?yàn)?TM 的壽命很短。一旦停止TM的穩(wěn)定（連續(xù)）輸注，TM就會(huì)被淘汰，UniCAR也會(huì)失活。事實(shí)上，該系統(tǒng)通過(guò)改變可以同時(shí)或以順序方式給予的TMs來(lái)實(shí)現(xiàn)大量腫瘤抗體的靶向選擇 [42]。

圖2. UniCAR-NK-92 對(duì) GD2+ 腫瘤細(xì)胞的作用

源自臍帶血的 NK 細(xì)胞

臍帶血是NK細(xì)胞的豐富而有趣的來(lái)源，因?yàn)閲?guó)際血庫(kù)有數(shù)十萬(wàn)個(gè)臍帶血 (UCB) 單位可供使用。NK細(xì)胞占臍帶淋巴細(xì)胞的15%至 30%。它們的表型比成人外周血細(xì)胞的表型更不成熟，具有非常特殊的特征，包括低CD16（低ADCC能力）、CD56 bright（比細(xì)胞毒性更具有增殖能力）、NKG2A+（一種抑制性受體，識(shí)別 HLA-E）和低 KIR（功能比其對(duì)應(yīng)物少）[43]。然而，這些限制可以通過(guò)使用細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)染的離體擴(kuò)增和激活來(lái)克服，并且根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，與來(lái)自血細(xì)胞的 CAR-NK 相比，來(lái)自臍帶血的 CAR-NK 細(xì)胞在流式細(xì)胞術(shù)中觀察到具有相同的激活特征。即使 UCB 中的 NK 細(xì)胞或多或少稀少，它們也具有非常重要的增殖能力，并且對(duì)細(xì)胞因子刺激非常敏感，可以進(jìn)行離體擴(kuò)增。

由 Tezvani 等人帶領(lǐng)的 MD Anderson 團(tuán)隊(duì)。最近發(fā)表了一項(xiàng)非常令人鼓舞的 I/II 期臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)在 11 名患有復(fù)發(fā)性難治性 B 細(xì)胞惡性腫瘤（從非霍奇金淋巴瘤到慢性淋巴細(xì)胞白血病）的患者中注射來(lái)自新鮮 UCB 的CAR-NK-CD19 細(xì)胞（ClinicalTrials.gov ，NCT03056339）（圖3）。用研究中使用的三種劑量之一（1×105、1×106或1×107每公斤細(xì)胞數(shù)）在淋巴清除化療（氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺）后。

值得注意的是，UCB NK細(xì)胞輸注后沒(méi)有注意到不良反應(yīng)或毒性，特別是CRS 或神經(jīng)毒性，試驗(yàn)中未達(dá)到最大耐受劑量。反應(yīng)在注射后的第一個(gè)月迅速出現(xiàn)，在11名受試者中，有7名患者完全緩解，并在 Richter 轉(zhuǎn)化中恢復(fù)到CLL狀態(tài)。盡管如此，重要的是要展示一個(gè)事實(shí)，即一半的患者在注射NK細(xì)胞后接受了維持治療，由來(lái)那度胺、利妥昔單抗、維奈托克或HSCT組成的綜合方案。在注射后長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月內(nèi)檢測(cè)到NK細(xì)胞。最有可能的是，在 CAR結(jié)構(gòu)中添加IL-15基因有助于CAR-NK細(xì)胞的長(zhǎng)期存活，盡管持久性機(jī)制尚未闡明。

此外，一個(gè)可能且非常重要的技術(shù)挫折是直接從新鮮UCB生產(chǎn) CAR-NK細(xì)胞，以及在生產(chǎn)后立即注射，沒(méi)有任何凍存步驟。事實(shí)上，由于從冷凍保存的細(xì)胞中選擇NK細(xì)胞的效率低，可能不應(yīng)該推薦使用來(lái)自國(guó)際銀行的冷凍保存的臍帶血來(lái)生產(chǎn)CAR-NK細(xì)胞。根據(jù) MD Anderson 團(tuán)隊(duì)的經(jīng)驗(yàn)，從新鮮臍帶血中擴(kuò)增可能是一種選擇——或者更確切地說(shuō)，建立選定的冷凍保存的NK細(xì)胞庫(kù)，這些細(xì)胞可以解凍和擴(kuò)增以進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。還應(yīng)注意的是，CAR-NK細(xì)胞在冷凍保存后活性有所降低，在目前的技術(shù)條件下，CAR-NK細(xì)胞應(yīng)在培養(yǎng)后立即給藥。即使CAR-NK細(xì)胞的具體長(zhǎng)期療效難以評(píng)估，并且該工藝在冷凍細(xì)胞上的可行性尚待確定，但結(jié)果非常有希望[44]。

圖3. 來(lái)自臍帶血的 CAR-NK 細(xì)胞：CAR-NK 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[45]，來(lái)自 MD 安德森中心。CAR-NK 細(xì)胞是從具有共刺激 CD28 結(jié)構(gòu)域的經(jīng)典 CD19 CAR 獲得的，其中添加了自殺基因和 IL-15 基因。

來(lái)自外周血的NK細(xì)胞

如前所述，大多數(shù)采用過(guò)繼性NK療法（不包括CAR-NK細(xì)胞）的研究都使用了來(lái)自單倍體相關(guān)或不相關(guān)供體的細(xì)胞，并已在兒童和成人AML中顯示出抗腫瘤反應(yīng) [29,46]。然而，缺點(diǎn)是需要從健康的成年志愿者那里收集細(xì)胞，這使得該過(guò)程比使用UCB稍微復(fù)雜一些。在細(xì)胞因子存在的情況下，一些簡(jiǎn)單的、符合GMP的培養(yǎng)條件可以將它們的擴(kuò)增提高25-55倍 [49]。如果來(lái)自PB的NK細(xì)胞與CB NK細(xì)胞相比具有高細(xì)胞毒性，那么在CAR-NK療法的背景下，供體在HLA不相容性方面的選擇是否應(yīng)該有所不同仍有待證明。

Leivas 等人的團(tuán)隊(duì)描述了一種可以使用和衍生自PBMC的方法[53]。在活化和擴(kuò)增的NK細(xì)胞 (NKAE) 和記憶T細(xì)胞 (CD45RA-T 細(xì)胞) 之間選擇效應(yīng)細(xì)胞。NK或T細(xì)胞在與NKG2D-4-1BB-CD3z-CAR 載體一起培養(yǎng)后轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用在NK和T細(xì)胞上表達(dá)的 NKG2D 激活劑受體，以及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的4-1BB（見上文）。NKG2D 具有特定的配體，包括 MICA、MICB 和 ULBP，它們?cè)趹?yīng)激細(xì)胞和許多腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，特別是在多發(fā)性骨髓瘤中。在體外，記憶T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)比其NK對(duì)應(yīng)物更穩(wěn)定。然而，CAR-NKAE細(xì)胞在體外對(duì)MM細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，同時(shí)保護(hù)健康細(xì)胞免受損傷。此外，在他們的小鼠異種移植骨髓瘤模型中，與T細(xì)胞相比，CAR-NKAE細(xì)胞表現(xiàn)出高效的細(xì)胞毒性和增強(qiáng)的抗骨髓瘤活性。

另一種方法是使用 Cas9/RNP 和腺相關(guān)病毒基因遞送的 CRISPR 靶向 CAR 基因插入。使用這種技術(shù)，產(chǎn)生了具有不同跨膜和信號(hào)結(jié)構(gòu)域（CD4/4-1BB+CD3ζ 和 NKG2D/2B4+CD3ζ）的靶向 CD33 的CAR-NK，并且似乎在原代NK細(xì)胞中顯示出增強(qiáng)的抗 AML活性 [54]。

源自 iPSC 的 NK 細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 是經(jīng)過(guò)基因重編程成為多能干細(xì)胞的分化細(xì)胞。成熟分化細(xì)胞重編程為 iPSC 的過(guò)程包括對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其表達(dá)四種基因：Klf4、C- myc、Oct3/4和Sox2，從而具有與胚胎干細(xì)胞相同的特征。因此，分化的成人重編程細(xì)胞獲得了無(wú)限增殖的潛力，并且在加入特定生長(zhǎng)因子后可以分化成任何細(xì)胞類型，這使得它在許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有用武之地——特別是再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞療法或遺傳病的模型化。這一發(fā)現(xiàn)獲得了 2012 年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，授予神戶大學(xué)（日本）研究員山中伸也 [55]。

由于它們的永生特性，單個(gè)iPSC足以生產(chǎn)和生成通用的 CAR-NK“現(xiàn)貨”產(chǎn)品。由iPSC產(chǎn)生的NK細(xì)胞具有不成熟的表型，具有低CD16、高 NKG2A和低KIR，具有較差的細(xì)胞毒性，但具有非常重要的增殖能力。為了增強(qiáng)它們的細(xì)胞毒性并使其持久存在，可以添加用于表達(dá)CD16 和 IL-15 或 IL-2的基因 [56, 57]。

FT596產(chǎn)品是第一個(gè)“即用型”、通用和同種異體CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品，源自iPSC技術(shù)，并且已經(jīng)獲準(zhǔn)在美國(guó)用于臨床研究 [58]。它由針對(duì)NK細(xì)胞優(yōu)化的抗CD19 CAR組成，具有激活劑受體 NKG2D的跨膜結(jié)構(gòu)域、2B4共刺激結(jié)構(gòu)域和 CD3ζ 信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。添加了兩個(gè)關(guān)鍵成分：

(i) 一種新型、高親和力、不可切割的 CD16 Fc 受體 (hnCD16)，可在沒(méi)有負(fù)調(diào)控的情況下實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向和增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性，并結(jié)合靶向治療性單克隆抗體腫瘤細(xì)胞；

(ii) 促進(jìn)細(xì)胞因子非依賴性持久性的 IL-15/IL-15 受體融合蛋白 (IL-15RF)（圖 4）。當(dāng)與利妥昔單抗（抗CD20）等單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)，F(xiàn)T596的hnCD16 Fc受體與覆蓋腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體的Fc部分結(jié)合，激活NK細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)ADCC。IL-15RF促進(jìn)NK細(xì)胞和活化的抗腫瘤 T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

ASH 2020期間的一份通訊報(bào)道了一名76歲女性在接受八線治療（包括 ASCT、自體過(guò)繼 T 細(xì)胞治療和活化的半相合NK細(xì)胞）后復(fù)發(fā)難治性 DLBCL 的病例 [59]。

圖4. 源自iPSC的 FT596 細(xì)胞的作用機(jī)制

該患者在淋巴清除單藥治療后接受了獨(dú)特劑量的30×106 FT596 細(xì)胞。除了中性粒細(xì)胞減少癥外，沒(méi)有報(bào)告與FT596細(xì)胞相關(guān)的副作用。在1個(gè)月閾值的腫瘤反應(yīng)評(píng)估顯示基于 2014 Lugano 標(biāo)準(zhǔn)的部分反應(yīng)，18 F-Glu 吸收減少超過(guò)70%，腫瘤大小減少超過(guò) 50%。該患者的第二劑 FT596 正在進(jìn)行中。一項(xiàng) I 期研究也在進(jìn)行中，估計(jì)有 285 名患者入組（clinicaltrials.gov：NCT04245722）。

同種異體 CAR-NK 細(xì)胞提供了許多有趣的視角，可以解決使用自體CAR-T細(xì)胞所面臨的一些問(wèn)題。迄今為止，同種異體NK細(xì)胞面臨的主要挫折是它們相對(duì)較短的作用持續(xù)時(shí)間，以及缺乏標(biāo)準(zhǔn)化工藝。與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞療法在很大程度上屬于起步階段；截至2022年5月1日，共有35項(xiàng)試驗(yàn)涉及CAR-NK細(xì)胞，與臨床試驗(yàn)網(wǎng)站上涉及CAR-T細(xì)胞療法的1181項(xiàng)試驗(yàn)相比，證實(shí)了這種創(chuàng)新療法的數(shù)據(jù)較少。CAR-NK細(xì)胞療法在抗擊癌癥方面具有廣闊的前景，但仍需更多研究加以論證。