cGAS-STING通路是天然免疫信號通路識別細(xì)胞質(zhì)異常DNA的主要傳感機(jī)制[1]。在哺乳細(xì)胞中cGAS與DNA結(jié)合后被激活，催化合成獨(dú)特的第二信使分子cGAMP。cGAMP與干擾素基因刺激因子（STING）結(jié)合后，招募并激活TBK1和IRF3，進(jìn)而誘導(dǎo)I型干擾素（IFNs）和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IFNs的產(chǎn)生能誘導(dǎo)數(shù)百種IFNs—刺激基因（ISGs）的表達(dá)，這對培養(yǎng)持續(xù)的腫瘤特異性T細(xì)胞極其重要。因此，STING成為癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

盡管有效的STING激動(dòng)劑被開發(fā)（包括環(huán)二核苷酸類，非核苷酸類化學(xué)小分子，ADC偶聯(lián)的STING激動(dòng)劑等），但STING激動(dòng)劑，以及激動(dòng)劑與PD-1/PD-L1聯(lián)用的臨床抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果并不理想；最近報(bào)道的ADC偶聯(lián)的STING激動(dòng)劑藥物XMT-2056在一期臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)了致命的副作用。因此，STING激動(dòng)劑的開發(fā)任重道遠(yuǎn)，需要繼續(xù)探索新的治療策略，以期望控制過度的免疫激活、降低免疫抑制和毒副作用，從而用于癌癥免疫治療。

近日，清華大學(xué)藥學(xué)院張從剛課題組與合作者在美國癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）旗下學(xué)術(shù)期刊 Cancer Immunology Research 上發(fā)表了題為：Discovery of Podofilox as a Potent cGAMP–STING Signaling Enhancer with Antitumor Activity 的研究論文。

該研究通過高通量篩選，發(fā)現(xiàn)一系列微管去穩(wěn)定劑（如：Podofilox、Nocodazole、Colchicine、 Vincristine sulfate等），均能顯著增強(qiáng)多種STING激動(dòng)劑介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。

研究團(tuán)隊(duì)以FDA批準(zhǔn)臨床抗病毒外用藥Podofilox為代表性分子深入解析了微管去穩(wěn)定劑調(diào)控cGAMP-STING通路的分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Podofilox通過抑制微管聚合、分散高爾基體、改變了STING激活后從ER到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)路線。其次，Podofilox延緩STING降解，持續(xù)可控地放大STING依賴的I型干擾素信號進(jìn)而促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞浸潤，并改善了腫瘤微環(huán)境。

研究團(tuán)隊(duì)將微管去穩(wěn)定劑與STING激動(dòng)劑聯(lián)合用于腫瘤免疫治療領(lǐng)域，并以Podofilox和cGAMP作為概念性證據(jù)，揭示了微管去穩(wěn)定劑+STING激動(dòng)劑在多種腫瘤模型（包括人肺癌類器官模型）中具有驚人的抗腫瘤治療效果。該研究提示可以通過STING激動(dòng)劑和微管去穩(wěn)定劑的精準(zhǔn)聯(lián)用，從而啟動(dòng)持續(xù)的STING天然免疫激活?？紤]到眾多微管去穩(wěn)定劑正在用于臨床癌癥治療，該發(fā)現(xiàn)具有廣泛的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景，有望為癌癥免疫治療提供全新的聯(lián)合治療方案。

研究團(tuán)隊(duì)首先以cGAS-STING天然免疫通路激活為表型，對市售小分子庫進(jìn)行高通量篩選（~150000 compounds），發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，多種結(jié)構(gòu)不同的微管去穩(wěn)定劑（或稱微管解聚劑），包括常用的長春花生物堿家族、秋水仙堿和MMAE等，能顯著增強(qiáng)cGAMP-STING信號通路。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)對比微管穩(wěn)定劑（Paclitaxel、Docetaxel）和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（Etoposide、Topotecan）對該通路的影響，發(fā)現(xiàn)僅有微管去穩(wěn)定劑能顯著增強(qiáng)cGAMP-STING信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖1）。其中， Podofilox對cGAMP-STING信號通路的增強(qiáng)作用最為顯著，且具有嚴(yán)格的濃度依賴性（有效協(xié)同濃度低至nM濃度水平）。

圖1. 僅有微管去穩(wěn)定劑能增強(qiáng)cGAMP-STING信號

接下來，研究團(tuán)隊(duì)探究Podofilox對不同STING激動(dòng)劑（CDNs、DMXAA、STING-agonist-3）介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的作用。此外，為了判定Podofilox對cGAMP-STING通路作用的特異性，研究者通過基因敲除（STING KO），小分子或仙臺病毒（SeV）等（LPS誘導(dǎo)TLR通路激活；Poly（I：C）和SeV誘導(dǎo)RNA通路激活）誘導(dǎo)不同天然免疫通路的激活，進(jìn)一步確定Podofilox能特異性增強(qiáng)STING信號級聯(lián)，并顯著促進(jìn)I型干擾素產(chǎn)生和ISGs基因表達(dá)（圖2）。

圖2. Podofilox特異性增強(qiáng)STING依賴的IFNs信號通路

由于間接IFN-α/β受體（IFNAR）信號通路也能介導(dǎo)ISGs基因的表達(dá)。研究者通過使用anti-IFNAR2抗體拮抗間接信號通路、基因敲除（Stat1 KO、Stat3 KO），以及IFNAR2激動(dòng)劑（RO8191）刺激等方式，進(jìn)一步確定Podofilox通過經(jīng)典的STING-TBK1-IRF3信號軸促進(jìn)了ISGs基因的表達(dá)（圖3）。

圖3. Podofilox主要通過直接的STING信號通路增強(qiáng)cGAMP介導(dǎo)的免疫反應(yīng)

接下來，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)性解析了Podofilox增強(qiáng)STING信號的分子機(jī)理。研究者首先通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)STING-GFP的細(xì)胞系可視化了STING激活后的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，發(fā)現(xiàn)Podofilox分散了cGAMP介導(dǎo)的STING核周puncta為貫穿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)的微小囊泡，在這些囊泡中誘導(dǎo)更強(qiáng)的STING寡聚化及TBK1、IRF3的磷酸化（圖4）。

圖4. Podofilox增加STING puncta數(shù)量，持續(xù)增強(qiáng)cGAMP-STING信號通路

研究團(tuán)隊(duì)推測，這些微管解聚劑誘導(dǎo)的STING散點(diǎn)表型可能通過破壞微管網(wǎng)絡(luò)，擾亂了STING激活后囊泡在細(xì)胞內(nèi)的正常運(yùn)輸。不出所料，我們通過超高分辨成像、免疫染色，及活細(xì)胞的延時(shí)拍攝發(fā)現(xiàn)cGAMP刺激后STING在60 min內(nèi)從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，并最終到達(dá)溶酶體被降解終止信號。然而，Podofilox通過抑制微管聚合，分散高爾基體改變了cGAMP刺激后STING轉(zhuǎn)運(yùn)模式，并顯著延緩轉(zhuǎn)運(yùn)中啟動(dòng)的STING降解和信號關(guān)閉（圖5）。

圖5. Podofilox通過抑制微管聚合，分散高爾基體，改變了STING激活后的轉(zhuǎn)運(yùn)路線并顯著延緩了STING降解

此外，Podofilox增強(qiáng)cGAMP介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是否能應(yīng)用于腫瘤的免疫治療呢？研究者分別在人肺癌類器官，小鼠腫瘤模型（B16F10黑素瘤；4T1乳腺癌）中進(jìn)一步探究微管去穩(wěn)定劑和STING激動(dòng)劑聯(lián)合的抗腫瘤療效。該團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明，Podofilox以宿主STING依賴的方式促進(jìn)cGAMP抗腫瘤活性和淋巴細(xì)胞免疫浸潤，并改善了腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮了強(qiáng)大的抗腫瘤作用，尤其是二者與PD-L1抗體聯(lián)合能進(jìn)一步擴(kuò)大治療效果。此外，在腫瘤類器官上的抗腫瘤作用強(qiáng)于肺癌一線化療藥Gemcitabine + Cisplatin。這些數(shù)據(jù)表明，微管去穩(wěn)定劑與STING激動(dòng)劑聯(lián)合可能在治療癌癥方面擁有巨大的潛力（圖6）。

圖6. Podofilox以宿主STING依賴的方式在體內(nèi)增強(qiáng)了cGAMP的抗腫瘤作用

綜上所述，該研究深入解析了微管去穩(wěn)定劑增強(qiáng)cGAMP-STING通路的分子機(jī)理。明確表明Podofilox通過抑制微管聚合，破壞STING激活后囊泡的正常轉(zhuǎn)運(yùn)并顯著延緩了STING降解，進(jìn)而誘導(dǎo)了更多的I型干擾素（IFNs）產(chǎn)生和更強(qiáng)的抗腫瘤免疫。在腫瘤模型中，Podofilox通過IFNs依賴的T細(xì)胞激活抑制腫瘤生長，并促進(jìn)腫瘤內(nèi)T細(xì)胞浸潤和PD-L1表達(dá)，這項(xiàng)研究擴(kuò)大了腫瘤免疫治療的益處，并可能為臨床癌癥的治療提供指導(dǎo)意義。

Podofilox破壞微管網(wǎng)絡(luò)分散cGAMP介導(dǎo)的STING puncta進(jìn)而放大STING信號級聯(lián)發(fā)揮抗腫瘤作用

清華大學(xué)藥學(xué)院張從剛課題組博士后韓晶、UTSW的胡水清和清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后胡亞偉為論文共同第一作者。清華大學(xué)藥學(xué)院張從剛研究員、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉鵬研究員和上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院孫序序研究員為論文通訊作者。